Парус Iнтернет-Консультант
Открытое тестирование
Открытое тестирование
МІНІСТЕРСТВО ОХОРОНИ ЗДОРОВ'Я УКРАЇНИ
НАКАЗ
03.02.2005 N 60
Про затвердження методичних вказівок
"Санітарно-мікробіологічний контроль
якості питної води"
Відповідно до статті 40 Закону України "Про забезпечення санітарного та епідемічного благополуччя населення" ( 4004-12 ) наказую:
1. Затвердити методичні вказівки "Санітарно-мікробіологічний контроль якості питної води" (додаються).
2. Департаменту державного санітарно-епідеміологічного нагляду Міністерства охорони здоров'я України методичні вказівки довести до установ і закладів державної санітарно-епідеміологічної служби, міністерств, інших центральних органів виконавчої влади в установленому порядку.
3. Контроль за виконанням наказу покласти на директора Департаменту державного санітарно-епідеміологічного нагляду Міністерства охорони здоров'я України Бережнова С.П.
Перший заступник Міністра, Головний державний
санітарний лікар України О.В.Лапушенко
Затверджено
Наказ МОЗ України
03.02.2005 N 60
Методичні вказівки
"Санітарно-мікробіологічний контроль
якості питної води"
1. Загальні положення
Санітарно-мікробіологічний контроль якості питної води встановлює ступінь її епідбезпеки відповідно до вимог, що пред'являються при централізованому питному водопостачанні ДСанПіНу N 383/1940 "Вода питна. Гігієнічні вимоги до якості води централізованого господарсько-питного водопостачання".
Основним санітарно-показовим тестом забруднення води виділеннями кишечника теплокровних залишаються бактерії групи кишкових паличок (БГКП). На відміну від переважної більшості країн в Україні збережено більш жорсткі вимоги до якості питної води щодо даного показника, тобто враховуються всі різновиди глюкозопозитивних коліформних бактерій, а не тільки лактозопозитивні варіанти. Такий підхід є обґрунтованим, оскільки цілий ряд лактозонегативних кишкових бактерій можуть не тільки потрапляти, а й за відповідних умов розмножуватися у питній воді і спричиняти негативний вплив на стан здоров'я людини. Для уточнення характеру забруднення води представниками кишкових бактерій у ДсанПіНі введено визначення термотолерантних кишкових бактерій (ТКБ). ТКБ є більш специфічними індикаторами фекального забруднення, легко виявляються і в значній мірі представлені саме Е.coli, тобто показником свіжого фекального забруднення. В окремих випадках, при отриманні незадовільних показників якості води та при незадовільному санітарно-гігієнічному стані системи водопостачання, проводиться визначення саме Е.coli.
Згідно з вимогами ДСанПіНу індекс БГКП (коліформні бактерії) визначається в об'ємі 1 куб. дм води, а ТКБ - відсутність у 100 куб. см. Проте визначення індексу БГКП в 1 куб. дм води передбачає кількісну оцінку, в той час як вимога відсутності ТКБ у 100 куб. см води свідчить лише про якісну оцінку, яка проводиться шляхом обов'язкового дослідження трьох об'ємів води по 100 куб. см.
У ДсанПіНі приділена також велика увага показнику "загальне мікробне число". При невідповідності якості питної води нормативам за органолептичними та іншими інтегральними показниками рекомендовано визначення загальної кількості мікроорганізмів при різних температурах інкубації - при (36 +- 1) град. С протягом 24 год. та при (22 +- 1) град. С протягом 48 год. Зростання числа колоній при інкубації (36 +- 1) град. С свідчить про можливе забруднення антропогенною мікрофлорою. Зростання числа бактерій, які розвиваються при (22 +- 1) град. С, свідчить про погіршення санітарно-гігієнічного стану системи водопідготовки чи водопостачання. Крім того, різке підвищення цього показника може свідчити про появу джерела забруднення або виникнення умов для вторинного розмноження мікроорганізмів. Визначення цього показника на етапах підготовки води несе суттєву інформацію щодо ефективності технології її очищення та знезараження.
Поряд з визначенням у воді санітарно-показових бактерій вперше введено визначення санітарно-показового вірусу - кишкових бактеріофагів. Виявлення їх у воді з резервуару чистої води свідчить про недосконалість технології водопідготовки, а у воді з мережі водопостачання, крім вказаного, - про наявність умов вторинного забруднення, зокрема збудниками вірусних інфекцій.
Вперше також введено визначення наявності патогенних бактерій та вірусів. Насамперед це визначення сальмонел, шигел, холерних вібріонів, ентеро-, адено- та ротавірусів. Передбачено також визначення наявності інших збудників бактеріальних та вірусних інфекцій у відповідності з наявною епідемічною ситуацією.
У ДСанПіНі збереглася розбіжність щодо термінології, прийнятої у більшості країн світової співдружності та існуючої в офіційних документах України. БГКП не є таксономічною групою, це утилітарна назва, і за визначенням до неї входять грамнегативні бактерії, що не утворюють спор, не мають ферменту оксидазу і ферментують глюкозу з утворенням кислоти та газу.
При дослідженні води джерел водопостачання визначаються лактозопозитивні кишкові бактерії (ЛКБ). Цей термін відповідає прийнятому у багатьох країнах терміну "загальні коліформи". Запропонований ДсанПіНом термін "термотолерантні кишкові бактерії" відповідає терміну "фекальні коліформи (ФК)".
3. Відбір, зберігання і транспортування проб води
Відбір проб води здійснює особа, яка володіє методикою відбору та умов транспортування проб.
Проби води відбирають у спеціально призначені для такого відбору води стерильні флакони місткістю не менше 500 куб. см зі щільно закритими пробками, які захищені та фіксовані ковпачками. Пробки повинні бути з матеріалу, який витримує стерилізацію сухим жаром чи в автоклаві. Ватно-марлеві пробки після стерилізації заміняють на стерильні щільні пробки.
Відбір проб проводять з дотриманням правил асептики: пробка з ковпачком знімається безпосередньо перед відбором проби, край флакона та пробка не повинні ні до чого торкатися. Після відбору проби флакон щільно закривають пробкою з ковпачком, який фіксують. Води відбирають стільки, щоб не замочити пробку під час транспортування. Якщо пробка замочилася, то це обов'язково відмічають у супроводжувальних документах (Акт відбору проб води ф. N 323/0, Направлення на санітарно-мікробіологічне дослідження ф. 205/0) та у Журналі реєстрації санітарно-мікробіологічних та санітарно-паразитологічних досліджень (ф. N 379/0).
Проби води з водорозбірних кранів відбирають після їх стерилізації шляхом фламбування тампоном, змоченим спиртом, і наступного спускання води протягом 10-15 хвилин при повністю відкритому крані. Воду відбирають безпосередньо з крану без гумових шлангів, водорозподільчих сіток чи інших насадок. Якщо через пробовідбірний кран відбувається постійний вилив води, відбір проб проводять без попереднього фламбування, не змінюючи напору води і наявної конструкції, облаштованих силіконовими чи гумовими шлангами.
Проби хлорованої водопровідної води відбирають в ємкості, куди попередньо для нейтралізації залишкової кількості дезінфектанту вносять до стерилізації 10 мг натрію сірчистокислого у вигляді кристалів чи 2 куб. см його 1,5% розчину на 500 куб. см води.
При відборі проб в одній і тій же точці для різних досліджень першими відбирають проби для бактеріологічних досліджень.
Відібрані проби маркують і супроводжують актом відбору проб води (ф. N 323/0), в якому вказують:
- при відборі проб з очисних споруд - етап очищення та місцезнаходження точки контролю;
- при відборі проб з периферичної водопровідної мережі - точне місце знаходження водорозбірного крану, з якого відбирали проби;
- нормативно-технічний документ, згідно якого проведений відбір;
- дату та час відбору і доставки проби;
- особливі обставини, які мали місце при відборі проб (час спуску води з крану, умови транспортування тощо);
- мету дослідження: відбір проби в порядку поточного санітарно-епідеміологічного нагляду, за епідпоказаннями чи за особливими обставинами (рекомендації санітарно-епідеміологічної служби, звернення населення при змінах органолептичних властивостей води тощо).
Доставка проб здійснюється в продезінфікованих термоконтейнерах при температурі (6 +- 2) град. С. В холодний період року контейнери повинні мати терморегулюючі прокладки, які запобігають промерзанню проб. При дотриманні вказаних умов термін початку дослідження від моменту відбору проб не повинен перевищувати 6 годин.
Якщо пробу неможливо охолодити, дослідження має бути проведеним не пізніше, ніж через 2 години після її відбору. В разі неможливості дотримання термінів доставки проби і температури зберігання аналіз проводити не рекомендується.
4. Обладнання, витратні матеріали, реактиви,
поживні середовища
4.1. Основне обладнання
- Термостат, що забезпечує регулювання температури від 25 до 55 град. С і градієнт температури в камері +- 1 град. С.
- Водяна баня, що підтримує робочий температурний режим 75 град. С з градієнтом температури +- 5 град. С.
- Водяна баня чи термостат, що здатні підтримувати температуру 45-50 град. С (для поживних середовищ).
- Прилад для мембранної фільтрації під вакуумом з діаметром фільтруючої поверхні 35 чи 47 мм, вакуумний насос для утворення розрідження 0,5-1,0 атм.
- Дистилятор, що забезпечує якість дистильованої води згідно з ГОСТом 6709-72, або прилад для отримання води аналітичної якості.
- Ваги лабораторні загального призначення 4-го класу точності, найвищий рівень зважування 200 г, допустима похибка не більше 0,02 г.
- Ваги лабораторні загального призначення 4-го класу точності, найвищий рівень зважування 1000 г, допустима похибка не більше 0,1 г.
- рН-метр з похибкою вимірювання до 0,01.
- Стерилізатор паровий з режимами стерилізації від температури +100 град. С (текучою парою) до 126 град. С (під тиском).
- Шафа сушильна стерилізаційна, яка забезпечує температуру + (100 - 200) град. С.
- Магнітні мішалки з підігрівом до 30 град. С для приготування середовищ.
- Дозатори для розливу поживних середовищ.
- Дозатори піпеточні для використання в аналізі.
- Холодильники лабораторні або побутові.
- Лупа вимірювальна 4-10х.
- Мікроскоп біологічний.
- Мікроскоп люмінесцентний.
- Прилад для підрахунку колоній бактерій.
- Сумки-холодильники або інша термоізолююча тара.
- Освітлювач ОИ-19.
- Прилад для струшування.
- Прилад для виміру оптичної щільності розчину (стандарт каламутності).
Примітка. допускається використання інших засобів вимірювальної техніки, допоміжного обладнання, яке за технічними характеристиками не поступається зазначеним вище.
4.2. Дрібне обладнання і витратні матеріали
- Мембранні фільтри нітрат- чи ацетатцелюлозні з діаметром пор 0,45 мкм, розміром 35 чи 47 мм; фільтраційні мембрани "Владіпор" МФАС-ОС-1, МФАС-ОС-2, МФА-МА (N 5-8) або аналогічні мембранні фільтри, які мають міжнародний сертифікат якості ISO 9000 чи EN 29 000.
- Пальники газові або спиртові.
- Індикаторні смужки для визначення рН у діапазоні 6-8 з інтервалом 0,2.
- Бактеріологічні петлі.
- Анатомічні пінцети для роботи з мембранними фільтрами.
- Штативи для пробірок.
- Фольга алюмінієва, ковпачки силіконові, металеві.
- Лабораторний посуд скляний або одноразового використання.
- Колби конічні об'ємом по 250 і 500 куб. см.
- Колби Бунзена для фільтрування під вакуумом.
- Флакони скляні об'ємом 100, 250, 500 куб. см.
- Лійки скляні.
- Пробірки бактеріологічні.
- Піпетки Мора на 50 і 100 куб. см.
- Стакани лабораторні.
- Скельця предметні для мікроскопії.
- Скельця покривні для мікроскопії.
- Чашки бактеріологічні (Петрі).
- Поплавки для пробірок і колб.
- Пінцети з тупими кінцями.
- Піпетки місткістю 1,0; 2,0; 5,0; 10,0 куб. см (за ГОСТом 20292-74).
- Циліндри місткістю 100, 250, 500 куб. см (за ГОСТом 1770-74).
- Мензурки місткістю 100, 250, 500 куб. см (за ГОСТом 1770-74).
- Папір фільтрувальний.
- Вата гігроскопічна медична (за ГОСТом 17206-71).
- Вата негігроскопічна (за ГОСТом 10477-63).
- Олівці чи фломастери по склу.
- Лейкопластир.
- Марля медична, бинти.
- Пенали металеві для піпеток.
- Кристалізатор (за ГОСТом 10973-64).
- Годинник піщаний на 1, 2, 5 хвилин (за ГОСТом 10576-63) або таймер.
4.3. Хімічні реактиви
Всі хімічні реактиви повинні відповідати кваліфікації не нижче ч.д.а.
------------------------------------------------------------------ |
--------------------
* речовини мають канцерогенну та мутагенну дію, працювати з дотриманням вимог безпеки праці. Доцільно використовувати стандартні препарати промислового виробництва, зареєстровані в Україні.
4.4. Поживні середовища промислового виготовлення:
- Агар сухий поживний.
- Агар Ендо сухий.
- Агар мікробіологічний (ГОСТ 17206-77).
- Агар сухий поживний лужний.
- Пептон основний сухий для накопичення холерного вібріону.
- Середовище Гіса з лактозою.
- Середовище Гіса з манітом.
- Середовище Гіса з глюкозою.
- Сухий поживний бульйон.
- Пептон сухий ферментативний для бактеріологічних досліджень (ГОСТ 13805-76).
- Середовище Плоскірєва.
- Агар з еозинметиленовим синім.
- Агар Мак Конкі.
- Агар ксилозолізиндезоксихолатний.
- Агар дезоксихолатцитратний.
- SS-агар.
- Діамантовий-зелений агар.
- Вісмут-сульфіт агар.
- Магнієве середовище.
- Селенітове середовище.
- Жовчний бульйон.
Діагностичні системи та набори типу: ЕНТЕРОтест (PLIVA-Lachema), АРІ (bioMereux) та ін. або системи індикаторні паперові (СІП): лактоза, маніт, оксидаза, глюкоза, маноза, сахароза, арабіноза, лізин, аргінін, орнітин.
4.5. Тест-штами мікроорганізмів
Контрольний коліфаг Т2, штам Е. coli С (тип штаму В, N 3240) або Е. coli В отримують у ДНДІ Генетика - Всеросійської колекції промислових мікроорганізмів (ВКПМ - Росія, 113545, м. Москва, 1-й Дорожний проїзд, д. 1). Штам коліфагу Т2, необхідний для перевірки чутливості мікроорганізму хазяїна Е. coli С та Е. coli В.
Штами Е. coli М17-02, Pseudomonas aeruginosa, Pseudomonas fluorescens отримують у музеї патогенних мікроорганізмів Інституту епідеміології та інфекційних хвороб ім. Л.В. Громашевського АМН України (03038, м. Київ-38, вул. М. Амосова, 5). Ці штами мікроорганізмів використовують для контролю нових партій реактивів для оксидазного тесту і діагностичних тест-систем та їх придатності при тривалому зберіганні. У виробничих лабораторіях, які знаходяться на території водопровідних станцій, не дозволяється культивувати, зберігати і використовувати штам Pseudomonas aeruginosa. У цих лабораторіях із зазначеною метою слід використовувати штам Pseudomonas fluorescens.
5. Приготування поживних середовищ і реактивів
5.1 Загальні відомості
Всі сухі поживні середовища і діагностичні імунобіологічні препарати повинні бути дозволені до використання в Україні і мати сертифікат якості (паспорт) відділу контролю організації-виробника та інструкцію з використання.
Варто використовувати стандартизовані сухі поживні середовища промислового виробництва. В цьому випадку слід дотримуватися способу приготування, використання, умов та терміну зберігання, вказаних на етикетці.
Сухі поживні середовища зберігають у сухих темних приміщеннях при кімнатній температурі. Відкриті упаковки щільно закривають. Середовища із зміненою консистенцією (ущільнені, з грудками) або зміненим кольором не використовують.
Приготовлення поживних середовищ проводиться згідно з ГОСТом 10444.1-84.
Усі виготовлені поживні середовища маркують із зазначенням назви середовища, дати виготовлення та терміну придатності.
Дату приготування та результати контролю якості поживних середовищ реєструють в "Журналі приготування та контролю поживних середовищ" (ф. N 256/0).
Для приготування розчинів, реактивів і поживних середовищ використовують воду дистильовану за ГОСТ 6709-72 або очищену. Готують у посуді з інертного матеріалу.
Всі середовища, які стерилізують при (112 +- 2) град. С, готують у стерильному посуді і розливають у стерильні пробірки.
Враховуючи можливу зміну рН поживних середовищ після кип'ятіння та стерилізації, при приготуванні середовищ встановлюють рН на 0,2 вище вказаного, що визначають дослідним шляхом для кожного середовища. Заключний контроль рН проводять у готовому середовищі з використанням рН-метра (рідкі середовища) або паперових індикаторів з шагом діапазону не більше 0,2 (агаризовані середовища). Визначення проводять згідно з інструкцією з використання приладу або індикаторної системи.
Після стерилізації поживні середовища охолоджують при кімнатній температурі, після чого поміщають у холодильник при (6 +- 2) град. С, якщо в Інструкції щодо застосування конкретного препарату не вказано інші умови зберігання.
Готові розлиті у пробірки напіврідкі поживні середовища та середовища з поплавками зберігають при кімнатній температурі не більше 7 діб.
Температуру середовищ, що зберігалися у холодильнику, перед посівом необхідно довести до кімнатної.
Якщо середовище необхідно розлити у чашки Петрі, то його охолоджують до температури 50-60 град. С.
На поверхні розлитого у чашки Петрі середовища не повинно бути слідів вологи. В разі наявності на поверхні середовища слідів вологи чашки перед використанням підсушують у термостаті.
5.2. Рецептура та методи приготування основних поживних середовищ та реагентів.
5.2.1. Стерильний 0,9%-ий фізіологічний розчин
9 г NaCl розчиняють у 1 куб. дм дистильованої води, розливають у пробірки по 10 куб. см або у флакони по 100 куб. см або більше, закривають пробками і стерилізують в автоклаві при (121 +- 1) град. С (1,1 кгс/кв. см) протягом 20 хв. Термін зберігання не більше двох тижнів.
Фізіологічний розчин, який готують для розведень, доцільно стерилізувати у флаконах по 90 куб. см та у пробірках по 9 куб. см.
5.2.2. Поживний бульйон
Застосовується для накопичення мікроорганізмів та є основою для приготування м'ясо-пептонного агару (МПА). Містить у собі органічні сполуки, необхідні для розмноження гетеротрофних мікроорганізмів.
Готують з сухого препарату промислового виробництва за способом, вказаним на етикетці.
5.2.3. Поживний бульйон (20-кратний) для визначення коліфагів готують шляхом збільшення у 20 разів наважки сухого препарату, вказаної на етикетці.
5.2.4. Поживний агар
Застосовується для отримання поверхневого та глибинного росту мікроорганізмів при визначенні загального мікробного числа, коліфагів, отримання ізольованого росту колоній мікроорганізмів та культивування еталонних культур.
При застосуванні поживного агару для визначення коліфагів не рекомендується використовувати високоочищений агар, оскільки іони Са та Mg є важливими факторами для адсорбції коліфагів до бактеріального хазяїна.
Використовують м'ясо-пептонний агар (МПА), в якому вміст агару мікробіологічного становить 2%, 1,5%, 1,0% та 0,7%.
Поживний агар забороняється витримувати у розтопленому стані більше 8 годин. Агар, що залишився, повторному розплавленню не підлягає.
5.2.4.1. Поживний агар промислового виробництва
Готують з сухого комерційного препарату за способом, вказаним на етикетці.
5.2.4.2. Поживний агар 0,7%-ий, 1,0%-ий; 1,5%-ий, 2%-ий
До 1 куб. дм МПБ (п. 5.2.2.) додають відповідно 7,0; 10,0; 15,0; 20,0 г агару у вигляді волокон чи порошку, нагрівають до повного розчинення, перевіряють рН 7,2-7,4, освітлюють, фільтрують у гарячому стані через ватно-марлевий фільтр і розливають у флакони чи пробірки в необхідних для аналізу кількостях. Стерилізують в автоклаві при (121 +- 1) град. С 15 хвилин.
5.2.5. Середовище Ендо
Слабоселективне диференційне середовище для виділення ентеробактерій.
Принцип дії: присутні у середовищі основний фуксин та сульфіт натрію (Na SO ) мають інгібуючу дію на грампозитивну мікрофлору.
2 3 Основний фуксин при додаванні сульфіту натрію знебарвлюється. Бактерії, які ферментують лактозу, змінюють реакцію у кислу сторону внаслідок утворення ацетилальдегіду, останній реагує з сульфітом натрію, і фуксин відновлює червоний колір. Тому лактозопозитивні бактерії формують колонії яскраво-рожевого та червоного кольору, часто з металевим зеленкуватим блиском та темно-червоним відбитком під колонією за рахунок ацетилальдегіду. Колонії бактерій, які не ферментують лактозу, безбарвні або блідо-рожеві.
5.2.5.1. Середовище Ендо промислового виробництва
Середовище Ендо випускається у вигляді сухого порошку. Склад та спосіб приготування вказано на етикетці. Готове середовище прозоре та має блідо-рожевий колір. Чашки Петрі з середовищем необхідно тримати в захищеному від світла місці. При необхідності зберігають у холодильнику не більше 3-х діб.
5.2.5.2. Модифікація середовища Ендо з додаванням фуксину
З метою збільшення диференційних властивостей у приготовлене та охолоджене до 60-70 град. С середовище перед розливом в чашки додають на 100 куб. см середовища 0,2 куб. см 5%-ного спиртового розчину основного фуксину. Після ретельного перемішування середовище розливають в чашки. Термін зберігання розчину фуксину не більше одного місяця. При дослідженні води після хлорування чи дії інших окисників додавати фуксин не бажано.
5.2.5.3. Модифікація середовища Ендо з додаванням розолової кислоти
Ця модифікація середовища Ендо використовується тільки при дослідженні води методом мембранної фільтрації у випадках, коли в питній знезараженій воді переважає мікрофлора, яка не відноситься до бактерій кишкової групи. Тоді, для попередження заростання посівів споровими аеробними бактеріями, окрім фуксину, на 100 куб. см середовища Ендо додають 0,2 куб. см 5%-вого спиртового розчину розолової кислоти. Термін зберігання розчину розолової кислоти - не більше одного місяця.
5.2.6. Глюкозо-пептонне середовище (ГПС)
ГПС використовують для визначення наявності у воді БГКП (коліформних бактерій).
Правильно приготовлені середовища за п.п. 5.2.6.-5.2.7. зеленого кольору з синюватим відтінком. При утворенні кислоти колір середовища змінюється на жовтий, при газоутворенні газ накопичується в поплавку та на поверхні.
Середовище готують двох видів: звичайне і концентроване.
5.2.6.1. Глюкозо-пептонне середовище звичайної концентрації
Склад середовища: 10 г пептону, 5 г хлористого натрію, 5 г глюкози, 1 куб. дм дистильованої води. Після розчинення вказаних інгредієнтів додають індикатор (2 куб. см 1,6%-вого спиртового розчину бромтимолового синього), встановлюють рН 7,4-7,6, розливають по 10 куб. см у пробірки з поплавками. Стерилізують в автоклаві при (112 +- 1) град. С 20 хв.
5.2.6.2. Глюкозо-пептонне середовище концентроване
При приготуванні концентрованого середовища кількість усіх інгредієнтів, крім води (п. 5.2.6.1), збільшують у 10 разів.
5.2.7. Лактозо-пептонне середовище (ЛПС)
ЛПС використовують для дослідження наявності у воді джерел водопостачання лактозопозитивних кишкових паличок. Середовище з лактозою готують відповідно п.п. 5.2.6.1, 5.2.6.2, але замість глюкози вносять 5 г лактози.
5.2.8. Напіврідке середовище Гіса з глюкозою або лактозою промислового виробництва
Використовують для визначення здатності мікроорганізмів ферментувати вуглеводи з утворенням кислоти та газу.
У напіврідких середовищах газ накопичується по ходу уколу або у товщі середовища, можуть утворюватися розриви середовища. Напіврідкі середовища найбільш чутливі до виявлення навіть невеликого, неінтенсивного газоутворення і дають можливість отримати відповідь через 4-6 годин. Для прискореної реакції роблять посіви масивною кількістю культури в середовище, яке попередньо нагрівають до температури майбутньої інкубації. При інкубації посівів більше ніж 5 годин газ може зникнути. У таких випадках на присутність газу вказують залишені в товщі середовища "кишені" - потемніння середовища на місці колишнього пухирця газу.
Середовище готують з сухого препарату за способом, вказаним на етикетці.
5.2.9. Напіврідке середовище з глюкозою чи лактозою
Використовують у відповідності до п. 5.2.8.
При відсутності препарату промислового виготовлення середовище готують за наступним прописом: в 1 куб. дм дистильованої води розчиняють 10 г пептону, 5 г натрію хлористого, 4-5 г агар-агару, доводять до кипіння, встановлюють рН (7,2-7,4), додають 1 куб. см 1,6%-го спиртового розчину бромтимолового синього. Стерилізують при (121 +- 1) град. С 20 хвилин. У розплавлене середовище вносять 5 г глюкози чи лактози, нагрівають до кипіння, розливають у стерильні пробірки по 3-5 куб. см і стерилізують при (112 + 1) град. С 12 хвилин.
5.2.10. Діагностичні системи та набори типу: ЕНТЕРОтест (PLIVA-Lachema), АРІ (bioMereux) та ін. або системи індикаторні паперові (СІП): лактоза, маніт, оксидаза, глюкоза, маноза, сахароза, арабіноза, лізин, аргінін, орнітин - використовують за прописом підприємства-виробника.
5.2.11. Середовища для визначення утворення індолу
Принцип дії: індол у поживному середовищі, в якому є амінокислота триптофан, утворюють мікроорганізми при наявності у них ферменту триптофанази. При додаванні до 2-добової бульйонної культури тест-реактива індол вступає з ним у реакцію, утворюючи рожеве або червоне забарвлення (реакція на індол позитивна).
В якості середовищ використовують бульйон Хотінгера, який завжди містить триптофан, або 2%-ну пептонну воду з додаванням 0,3%-ного триптофану.
5.2.11.1 Тест-реактив для визначення індолу (Ковача)
------------------------------------------------------------------ |
Приготування: розчинити альдегід у спирті при легкому нагріванні (на водяній бані при 50-55 град. С) і повільно додати кислоту. Альдегід повинен бути світлим, а готовий реактив - прозорим. Реактив Ковача готують невеликими партіями і зберігають у холодильнику при (6 +- 2) град. С не більше 3-4 тижнів.
5.2.11.2.Тест-реактив для визначення індолу (Еріха)
------------------------------------------------------------------ |
Приготування: альдегід розчиняють у спирті, додають кислоту. Зберігають у темному місці.
5.2.11.3 Індикаторні папірці для визначення індолу
------------------------------------------------------------------ |
Приготування: розчинити альдегід у спирті при легкому нагріванні (на водяній бані при 50-55 град. С) і повільно додати кислоту. Альдегід повинен бути світлим, а готовий реактив - прозорим. Отриманою теплою рідиною змочують смужки фільтрувального паперу, висушують і нарізають вузькими смужками.
Колір папірця жовтий. При наявності індолу колір папірця змінюється від бузково-рожевого до інтенсивного малинового. Поява інших кольорів на індикаторному папері не враховується.
5.2.12. Цитратний агар Симонса
Цитратне середовище Симонса призначене для диференціації ентеробактерій за їх здатністю використовувати натрію цитрат в якості єдиного джерела вуглецю.
Принцип дії: бактерії, які мають відповідні ензими, здатні розвиватися на середовищах, в яких єдиним джерелом вуглецю є цитрат. При рості бактерій колір середовища змінюється на синій (лужна реакція). Ентеробактерії, які не мають здатності використовувати цитрат, на середовищі Симонса не ростуть. Колір середовища залишається без змін.
5.2.12.1. Цитратний агар Симонса промислового виробництва випускається у сухому вигляді. Спосіб застосування вказаний на етикетці.
5.2.12.2. У разі відсутності промислового препарату середовище готують наступним чином.
------------------------------------------------------------------ |
Приготування: попередньо ретельно відмитий агар розчиняють при підігріванні у дистильованій воді. Всі солі розчиняють у невеликому об'ємі води, а потім додають до розтопленого агару і доводять до 1 куб. дм. Встановлюють рН 7,2, додають індикатор у вигляді 0,2%-ного водного розчину в об'ємі 40 куб. см, добре перемішують та розливають у пробірки по 5-7 куб. см. Стерилізують при (121 +- 1) град. С 15 хв. або при (112 +- 2) град. С 30 хв. При охолодженні скошують стовпчик 2-2,5 куб. см.
5.2.13. Фосфатно-буферна пептонна вода
Використовують як середовище попереднього збагачення при визначенні сальмонел та шигел. Готують середовище одинарної та подвійної концентрації.
------------------------------------------------------------------ |Склад: |Калію дигідрофосфат (КН РО ) | 1,5 г | | | 2 4 | | | |--------------------------------------+----------------| | |Натрію гідрофосфат безводний (Na НРО )| 9,0 г | | | 2 4 | | | |--------------------------------------+----------------| | |Натрію хлорид | 5,0 г | | |--------------------------------------+----------------| | |Пептон ферментативний | 10,0 г | | |--------------------------------------+----------------| | |Вода дистильована | 1 куб. дм | ------------------------------------------------------------------ |
Приготування: інгредієнти змішують, розливають по 9 куб. см у пробірки або флакони по 90 куб. см, встановлюють рН та стерилізують при (121 +-) 1 град. С 20 хв.
Для приготування середовища подвійної концентрації на 1 куб. дм дистильованої води наважки подвоюють.
5.2.14.1 Селенітове середовище
Середовище призначене для накопичення сальмонел та шигел.
Принцип дії: середовище містить гідроселеніт натрію, який пригнічує розвиток супутньої мікрофлори, та поживні речовини і фосфати, які забезпечують умови для розвитку мікроорганізмів.
-----------------------------------------------------------------
|Склад: | Натрію гідроселеніт (без домішок | 4,0 г |
| | телуриту) (NaHSeO ) | |
| | 3 | |
| |--------------------------------------+---------------|
| | Пептон високої якості ("Діфко", | 5,0 г |
| | "Ріхтер", "Спофа") | |
| |--------------------------------------+---------------|
| |Натрію гідрофосфат безводний (Na НРО )| 7,0 г |
| | 2 4 | |
| |--------------------------------------+---------------|
| | Натрію дигідрофосфат безводний | 3,0 г |
| | (Na Н РО ) | |
| | 2 2 4 | |
| |--------------------------------------+---------------|
| | Лактоза | 4,0 г |
| |--------------------------------------+---------------|
| | Вода дистильована | 1 куб. дм |
----------------------------------------------------------------- |
Приготування: середовище готують з двох розчинів.
I розчин: попередньо визначають кількісне співвідношення фосфатів для даного зразка пептону чи гідроселеніту натрію з тим, щоб готове середовище мало рН 6,9-7,1. Таке визначення потрібне кожного разу при зміні серії кожного з основних інгредієнтів, які входять до середовища.
Після встановлення співвідношення фосфатів до розчину додають пептон та лактозу. Розливають у флакони по 50 куб. см і стерилізують при (112 +- 1) град. С 30 хв.
II розчин: розчин готують ех tempore. До 100 куб. см дистильованої води додають 10 г гідроселеніту натрію.
Перед початком роботи у кожний флакон з 50 куб. см основного розчину (I) додають 2 куб. см гідроселеніту натрію (II). Стерилізація не потрібна.
Основний розчин (I) зберігають при температурі (6 +- 2) град. С протягом 1-2 місяців.
Для приготування середовища подвійної концентрації маси інгредієнтів збільшують у два рази. Основний розчин (I) подвійної концентрації розливають у флакони по 500 куб. см та стерилізують, як вказано вище.
До 500 куб. см досліджуваної проби води додають 500 куб. см основного розчину подвійної концентрації та 40 куб. см 10%-ного розчину гідроселеніту натрію, який виготовлено ех tempore.
5.2.14.2. Селенітове середовище Лейфсона, сухе промислового виробництва.
Середовище призначене для накопичення сальмонел та шигел.
Принцип дії: середовище містить гідроселеніт натрію, який пригнічує розвиток супутньої мікрофлори, поживні речовини та фосфати, які забезпечують умови для розвитку мікроорганізмів. Випускається у сухому вигляді. Спосіб застосування вказаний на етикетці.
5.2.15.1. Магнієве середовище
Середовище призначене для накопичення сальмонел.
Принцип дії: інгібуючий ефект середовища на супутню мікрофлору води базується на дії діамантового зеленого та магнію хлориду, при цьому у концентраціях, які використовуються, вони не діють на розвиток сальмонел. Пептон та дріжджовий діалізат сприяють розвитку сальмонел, а дигідрофосфат калію забезпечує необхідну реакцію рН.
Середовище складається з трьох розчинів.
------------------------------------------------------------------ |Склад: | Розчин I | | |------------------------------------------------------| | | Пептон | 4,2 г | | |-------------------------------------+----------------| | | Натрію хлорид (NaCl) | 7,15 г | | |-------------------------------------+----------------| | | Калію дигідрофосфат (КН РО ) | 1,93 г | | | 2 4 | | | |-------------------------------------+----------------| | | Дріжджовий діалізат | 9,0 куб. см | | |-------------------------------------+----------------| | | Вода дистильована | 890 куб. см | | |------------------------------------------------------| | | Розчин II | | |------------------------------------------------------| | | Магнію хлорид (MgCl х 6Н О) | 35,7 г | | | 2 2 | | | |-------------------------------------+----------------| | | Вода дистильована | 90 куб. см | | |------------------------------------------------------| | | Розчин III | | |------------------------------------------------------| | | Діамантовий зелений 0,5%-ий водний | 0,9 куб. см | | | розчин | | ------------------------------------------------------------------ |
Приготування: після розчинення при підігріванні інгредієнтів всі три розчини змішують, розливають по 50 куб. см у флакони і стерилізують при (112 +- 1) град. С 30 хв.
У середовище подвійної концентрації входять інгредієнти у кількості, збільшеній у 2 рази. Середовище подвійної концентрації розливають по 500 куб. см у флакони. При його використанні до 500 куб. см середовища додають 500 куб. см води, яка досліджується.
5.2.15.2. Магнієве середовище, сухе промислового виробництва
Середовище призначене для накопичення сальмонел.
Принцип дії: інгібуючий ефект середовища на супутню мікрофлору води базується на дії діамантового зеленого та магнію хлориду. При при цьому у концентраціях, які використовуються, вони не діють на розвиток сальмонел. Пептон та дріжджовий діалізат сприяють розвитку сальмонел, а дигідрофосфат калію забезпечує необхідну реакцію рН.
Випускається у сухому вигляді. Спосіб застосування вказаний на етикетці.
5.2.16. Середовище Мюлера
Тетратіонатний бульон Мюлера є середовищем накопичення для сальмонел.
Принцип дії: при додаванні до середовища тіосульфату натрію та розчину Люголя ех tempore утворюється тетратіонат натрію. Ця сполука майже не затримує розвиток більшої частини сальмонел. В той же час вона інгібує іншу мікрофлору кишечнику. Бульйон у середовищі забезпечує поживні речовини, крейда має буферні властивості.
------------------------------------------------------------------ |Склад: |Крейда | 45,0 г | | |-------------------------------------+----------------| | | 3 | | | |Кальцію карбонат (СаСО ) | 25,0 г | | |-------------------------------------+----------------| | |Бульон Хотінгера, який має 1,2-1,3% | 900 куб. см | | |амінного азоту | | | |-------------------------------------+----------------| | |Розчин Люголя | 20 куб. см | | |-------------------------------------+----------------| | |Натрію тіосульфат (Na S О х 5Н О) | | | | 2 2 3 2 | | | |50%-ий стерильний розчин | 100 куб. см | ------------------------------------------------------------------ |
Приготування: в стерильні флакони додають 45 г крейди, стерилізують сухим жаром, після чого додають 900 куб. см бульйону Хоттінгера. Стерилізують при (121 +- 1) град. С 30 хв., рН 7,2-7,4.
Ех tempore асептично додають 20 куб. см розчину Люголя та 100 куб. см натрію тіосульфату, добре перемішують і розливають у флакони у необхідному об'ємі. Готове середовище не стерилізують.
------------------------------------------------------------------ |Розчин | Калію йодит (КІ) | 20,0 г | |Люголя: |-------------------------------------+----------------| | | Йод кристалічний | 25,0 г | | |-------------------------------------+----------------| | | Вода дистильована | 100 куб. см | ------------------------------------------------------------------ |
Розчин не використовують до повного розчинення йоду кристалічного. Зберігають у флаконі з темного скла.
------------------------------------------------------------------ |Розчин натрію | тіосульфат натрію | 50,0 г | |тіосульфату: |--------------------------+----------------| | | вода дистильована | 100 куб. см | ------------------------------------------------------------------ |
Тіосульфат натрію розчиняють у воді та стерилізують при (112 +- 1) град. С 20 хв.
5.2.17. Середовище з охмеленим суслом
Середовище використовується для накопичення шигел та сальмонел.
Принцип дії: інгібуюча дія на супутню мікрофлору здійснюється за рахунок діамантового зеленого та рН. Наявність охмеленого сусла сприяє активному розвитку шигел і сальмонел.
------------------------------------------------------------------ |Склад:| охмелене сусло | 125,0 куб. см | | |----------------------------------------+----------------| | | пептон ферментативний | 6,3 г | | |----------------------------------------+----------------| | | розчин діамантового зеленого 0,1%-ий | 8,7 куб. см | ------------------------------------------------------------------ |
Приготування: середовище готують ех tempore наступним чином: охмелене сусло наливають у стерильний посуд відповідної ємкості, додають пептон, розмішують, доводять до кипіння, охолоджують, доливають 500 куб. см досліджуваної води, доводять рН до 7,8, додають діамантовий зелений.
5.2.18. Жовчний бульйон
Середовище для накопичення та подальшого визначення шигел.
Принцип дії: шигели, сальмонели та деякі інші представники кишкових бактерій є стійкими до дії високих концентрацій жовчі, що надає їм селективну перевагу.
------------------------------------------------------------------ |Склад: | м'ясо-пептонний бульйон | 900,0 куб. см | | |------------------------------------+-------------------| | | жовч великої рогатої худоби | 100,0 куб. см | ------------------------------------------------------------------ |
Приготування: жовч додають до бульйону. Встановлюють рН не нижче 7,6. Розливають у пробірки або флакони. Стерилізують при (121 +- 1) град. С 20 хв.
5.2.19. Вісмут-сульфіт агар
Селективне середовище для виділення сальмонел.
Принцип дії: діамантовий зелений та вісмут, які є у складі середовища, інгібують ріст грампозитивної мікрофлори та багатьох ентеробактерій, в тому числі і шигел. Ріст сальмонел також може бути затриманий, тому чашки з посівами передивляються через 24 та 48 годин. Аглютинуюча здатність сальмонел, які виросли на цьому середовищі, також знижена. Диференційні властивості середовища полягають у тому, що сірководень, який утворюють бактерії з сульфіту заліза, викликає почорніння індикатора безбарвного сульфіту вісмуту. Тому бактерії, які утворюють сірководень, формують чорні, чорні з коричневим або з темно-зеленим відтінком колонії. Багато з них мають металевий блиск. Середовище під колоніями має чорний колір. Бактерії, які не утворюють сірководень, виростають у вигляді дрібних, безбарвних, зеленкуватих або коричневих колоній.
Середовище випускається у сухому вигляді. Склад та спосіб приготування вказані на етикетці. Середовище непрозоре, зеленкувато-горіхового кольору.
5.2.20. Пептон основний сухий
Призначений для приготування рідкого поживного середовища збагачення - пептонної води, яка використовується для виділення та культивування холерних вібріонів.
Принцип дії: в пептонній воді холерний вібріон випереджає за темпом росту супутню бактеріальну флору і накопичується в найбільшій кількості на поверхні, утворюючи ніжну плівку. У зв'язку з цим для пересівів та приготування мазків необхідно брати плівку або рідину з поверхні середовища.
5.2.20.1. Основний розчин пептону.
Використовується як 10%-ий розчин для приготування 1%-ної пептонної води при додаванні до досліджуваної проби (1-е середовище збагачення). Готують з сухого промислового препарату за способом, вказаним на етикетці. Зберігається до 2 років.
5.2.20.2. Пептонна вода 1%-на.
Основний розчин пептону розводять у співвідношенні 1:10 дистильованою водою. Після встановлення рН 8,4 +- 0,2 розливають в пробірки або флакони і стерилізують під тиском 0,7 атм. 20 хвилин. 1%-ну пептонну воду можна готувати безпосередньо із комерційного препарату, для чого беруть наважку, в 10 разів меншу, ніж в рецепті основного пептону.
Готове середовище прозоре, блідо-жовтого забарвлення.
5.2.20.3. Пептонна вода з телуритом калію - селективне середовище збагачення для холерного вібріона.
Принцип дії: телурит калію інгібує ріст супутньої мікрофлори. В 1%-ну пептонну воду після стерилізації додають телурит калію до кінцевої концентрації його в середовищі 1:100000 або 1:200000. Попередньо готують робочий 0,1%-ий розчин телуриту калію.
Термін зберігання робочого розчину 7 днів, а поживних середовищ з телуритом не більше 48 год. за умови зберігання в холодильнику.
5.2.21. Лужний агар сухий
Поживне середовище для виділення та культивування холерного вібріону.
Середовище випускається у сухому вигляді. Склад та спосіб приготування вказані на етикетці. Готове середовище прозоре, жовтого кольору.
Всі поживні середовища, інгібітори сторонньої мікрофлори, які використовуються для діагностики холери, підлягають бактеріологічному контролю.
5.2.22. Агар Плоскірєва
Агар Плоскірєва - селективне середовище для виділення шигел та сальмонел.
Принцип дії: до складу середовища входять жовчні солі, діамантовий зелений та йод, які інгібують ріст грампозитивної флори, значно затримують ріст ешеріхій та іншої супутньої мікрофлори (перші 24 години). Диференційні властивості базуються на зміні рН у кислу сторону при розвитку лактозопозитивних бактерій, які утворюють колонії жовто-рожевого кольору. Лактозонегативні бактерії виростають безбарвними або слабо забарвленими.
Середовище випускається у сухому вигляді. Склад та спосіб приготування вказані на етикетці. Готове середовище прозоре, має рожево-жовтий відтінок.
5.2.23. Агар з еозин-метиленовим синім (ЕМС)
Слабоселективне середовище для виділення ентеробактерій.
Принцип дії: середовище має певну інгібуючу дію на грампозитивну мікрофлору. При ферментації лактози чи сахарози утворюється кислота. Комплекс індикаторів випадає в осад при рН 4,7, забарвлюючи кислотоутворюючі бактерії в темно-фіолетовий, майже чорний колір, часто з зеленим блиском. Бактерії, які не ферментують вказані вуглеводи, утворюють безбарвні або рожеві колонії.
ЕМС випускається у сухому вигляді. Склад та спосіб приготування вказані на етикетці. Готове середовище прозоре, має фіолетово-рожевий колір.
5.2.24. Середовища з антибіотиками
Використовуються для виділення шигел.
Принцип дії: базується на стійкості шигел до антибіотиків, які широко використовуються на практиці (левоміцетин, тетрациклін та ін.). Вибір антибіотика залежить від резистентності шигел, які циркулюють у даній місцевості. Антибіотики додають до звичайних середовищ.
------------------------------------------------------------------ |Склад: | агар Плоскірєва, Ендо, ЕМС | 1000,0 куб. см | | | (розплавлені) | | | |--------------------------------------+----------------| | | антибіотик у вигляді водно-спиртового| 5-12,0 куб. см | | | розчину | | | |--------------------------------------+----------------| | | спирт етиловий 96 град. | 10,0 куб. см | | |--------------------------------------+----------------| | | вода дистильована | 40,0 куб. см | ------------------------------------------------------------------ |
Розчини антибіотиків готують наступним чином.
Розчин левоміцетину:
------------------------------------------------------------------ |Склад: | лівоміцетин | 50,0 мг | | |--------------------------------------+----------------| | | спирт етиловий 96 град. | 10,0 куб. см | | |--------------------------------------+----------------| | | вода дистильована | 40,0 куб. см | ------------------------------------------------------------------ |
Приготування: розчинити антибіотик у спирті і довести об'єм до 50 куб. см стерильною дистильованою водою. Розчин можна зберігати у холодильнику протягом місяця.
Розчин тетрацикліну (1000 мкг. см)
------------------------------------------------------------------ |Склад: |тетрацикліну гідрохлорид | 100000 ЕД (100 мг) | | |---------------------------------+---------------------| | |вода дистильована | 100,0 куб. см | ------------------------------------------------------------------ |
Приготування: розчин готують безпосередньо перед використанням.
Антибіотики вводять у поживні середовища, знижуючи концентрацію основного розчину у 4-5 разів.
5.2.25. Агар Кліглера
Середовище призначене для диференціації ентеробактерій, холерних вібріонів за їх здатністю ферментувати глюкозу та лактозу, а також утворювати сірководень.
Принцип дії: при ферментації вуглеводів утворюється кислота. Присутній у середовищі індикатор феноловий червоний забарвлює його у жовтий колір. Бактерії, які утилізують тільки глюкозу, забарвлюють середовище у жовтий колір. Подальше використання бактеріями пептону призводить до виділення аміаку, що проявляється у появі червоного кольору у скошеній частині середовища. Стовпчик залишається жовтим.
При ферментації бактеріями глюкози та лактози теж утворюється жовтий колір, але тому, що лактози у 10 разів більше, ніж глюкози, жовтий колір стовпчика та скошеної частини залишається, оскільки переважає кисла реакція. Однак через 48 годин інкубації також відбуватиметься почервоніння скошеної частини середовища за рахунок розщеплення пептонів.
Якщо при ферментації вуглеводів утворюється газ (Н2 , СО2 ), то з'являються розриви середовища.
При наявності у ентеробактерій здатності утворювати сірководень з неорганічних сполук сірки у середовищі, до якого входять тіосульфат та залізо, з'являється чорний колір у стовпчику середовища.
Середовище випускається у сухому вигляді. Склад та спосіб приготування вказані на етикетці. Після стерилізації середовище скошують так, щоб залишився стовпчик висотою 2-2,5 см.
Готове середовище має червоно-бурий або помаранчово-червоний колір.
5.2.26. Трицукровий агар з сечовиною (Олькеницького)
Принцип дії: стосовно ферментації вуглеводів та утворення сірководню принцип дії той же, що вказано для агару Кліглера. Уреазопозитивні бактерії ферментують сечовину з утворенням аміаку, під дією якого усе середовище набуває червоного кольору. Тому у такому випадку визначення ферментації неможливе і для визначення цукролітичної дії бактерій необхідно застосувати інші середовища.
------------------------------------------------------------------ |Склад: |агар поживний сухий |25,0 г | | |-----------------------------------------+--------------| | |лактоза |10 г | | |-----------------------------------------+--------------| | |сахароза |10 г | | |-----------------------------------------+--------------| | |глюкоза |1 г | | |-----------------------------------------+--------------| | |амоній-залізо (II) сульфат |0,2 г | | |(FeSO х (NH ) 2SO х 6Н О) | | | | 4 4 4 2 | | | |-----------------------------------------+--------------| | |натрію тіосульфат (Na S О х 5Н О) |0,3 г | | | 2 2 3 2 | | | |-----------------------------------------+--------------| | |сечовина |10 г | | |-----------------------------------------+--------------| | |феноловий червоний (0,4%-ий водний |4,0 куб. см | | |розчин) | | | |-----------------------------------------+--------------| | |вода дистильована |1000 куб. см | ------------------------------------------------------------------ |
Приготування: солі попередньо розчиняють у невеликій кількості дистильованої води. Вуглеводи і сечовину розчиняють таким же чином, але при підігріванні на водяній бані. Сухий поживний агар розплавляють у решті воді при нагріванні на вогні і перемішуванні. Потім всі інгредієнти об'єднують, перемішують з розплавленим агаром, фільтрують через марлевий фільтр, встановлюють рН 7,2-7,4. Додають індикатор, добре перемішують, розливають у пробірки по 6-7 куб. см. Стерилізують текучим паром 3 дні підряд по 20 хв. або при (112 +- 1) град. С 15 хв. Скошують, залишаючи стовпчик 2,0-2,5 куб. см.
Середовище випускається у сухому вигляді. Склад та спосіб приготування вказані на етикетці.
Готове середовище блідо-рожевого кольору.
5.2.27. Середовище Ресселя
Призначене для диференціації вібріонів за їх здатністю ферментувати глюкозу та лактозу.
Принцип дії: при ферментації вуглеводів спостерігається характерна для кислої реакції зміна кольору стовпчика і збереження кольору скошеної частини без утворення газу.
Середовище випускається у сухому вигляді. Склад та спосіб приготування вказані на етикетці. Готове середовище рожевого або зеленого кольору, в залежності від індикатора.
Елективні поживні середовища промислового виготовлення можуть використовуватись згідно з інструкціями виробника.
5.2.28. Реактив для визначення оксидазної активності бактерій
Оксидазний тест призначається для диференціації бактерій родини Enterobacteriaceae від родини Vibrionaceae, грамнегативних бактерій родини Pseudomonadaceae та інших водних сапрофітних бактерій, які мають активний фермент оксидазу та окислюють фенілендіамінові сполуки до індофенолу яскраво синього кольору.
Використовують готові індикаторні системи промислового виготовлення (системи індикаторні паперові (СІП-оксидаза), диски оксидази виробництва PLIVA-LACHEMA, bioMerieux) чи папірці, попередньо виготовлені за таким прописом:
30 мг альфа-нафтолу розчиняють в 2,5 куб. см 96%-вого етилового спирту, додають 7,5 куб. см дистильованої води з 50 мг фенілендіамінової сполуки. В отриманому розчині змочують фільтрувальні папірці, висушують і зберігають у темному місці в чорному папері не більше 6 місяців.
Використовують також таку методику:
Реактив N 1. 1%-ий спиртовий розчин альфа-нафтолу.
Реактив N 2. 1%-ий водний розчин фенілендіамінової сполуки.
Розчини зберігають в темних флаконах з притертими пробками: N 1 - до одного місяця, N 2 - один тиждень. Перед застосуванням до трьох частин розчину N 1 додають сім частин розчину N 2.
З кожною новою партією реактивів, а також періодично в процесі зберігання реактивів чи готових препаратів проводять контрольні дослідження з тест-культурами мікроорганізмів, які дають позитивну реакцію (Pseudomonas aeruginosa або Pseudomonas fluorescens) і негативну реакцію (Е. coli).
Надійний результат оксидазного тесту може бути отриманий лише при використанні добової культури, вирощеної на неселективному поживному агарі. Слід зауважити, що при постановці оксидазного тесту шляхом нанесення мембранного фільтра на оксидазний реактив, постановці реакції з колонією, що вирощена на середовищі Ендо, типові темно-червоні колонії можуть давати нечітку реакцію.
Увага! Для постановки тесту використовують скляну паличку або платинову петлю.
5.2.29. Постановка оксидазного тесту при роботі методом мембранних фільтрів.
Мембранний фільтр, на якому виросли колонії бактерій, переносять пінцетом, не перевертаючи, на добре змочений реактивом кружок фільтрувального паперу дещо більшого діаметру ніж фільтр. Через 2-4 хв. визначають результат і фільтр негайно повертають на середовище Ендо. Всі колонії, що посиніли або мають синій обруч, не відносяться до родини Enterobacteriaceae і їх не враховують.
Колонії, що не змінили свого забарвлення, в більшості утворені бактеріями родини Enterobacteriaceae, але серед них можуть бути коки, спороутворюючі та грамнегативні палички, які не мають санітарно-показового значення,. Їх не враховують після мікроскопії та в разі відсутності утворення газу на напіврідкому середовищі з глюкозою при (36 +- 1) град. С.
Беручи до уваги бактерицидність реактиву для визначення оксидазної активності, рекомендують при достатньому розмірі колонії половину колонії використовувати для постановки оксидазного тесту та приготування мазку для мікроскопії. Залишок колонії пересівають у напіврідке середовище з глюкозою чи лактозою.
5.2.30. Постановка оксидазного тесту при роботі титраційним методом
З ізольованої колонії кожного типу, які виросли на секторах середовища Ендо, знімають частину колонії платиновою петлею або скляною паличкою і наносять штрихом на фільтрувальний папір, змочений реактивом. Якщо в місці нанесення бактеріальної маси папір не змінює кольору - оксидазний тест негативний, якщо папір синіє протягом 1 хв., значить бактерії мають активну оксидазу.
Дослідження ізольованих колоній є обов'язковим, інакше можна безпідставно відкинути належність досліджуваної колонії до кишкових паличок в разі посиніння за рахунок домішок оксидазопозитивних бактерій. При негативному оксидазному тесті залишок колонії при потребі пересівають на напіврідке середовище з глюкозою чи лактозою.
5.2.31. Реактиви для фарбування за Грамом
Карболовий розчин генціану фіолетового: 1 г генціану фіолетового, 10 куб. см ректифікованого етилового спирту, 5 г фенолу розтирають у ступці, додають 100 куб. см дистильованої води.
Розчин Люголя: 1 г йоду кристалічного, 2 г йодистого калію розчиняють в 300 куб. см дистильованої води. Зберігають у флаконі з темного скла.
Фуксин Ціля: 1 г основного фуксину, 10 куб. см спирту етилового ректифікованого, 5 г фенолу розтирають в ступці, додаючи 100 куб. см дистильованої води.
5.2.32. Фарбування за Грамом
Мазок на предметному склі фіксують трьохкратним проведенням через полум'я пальника. На препарат накладають смужку фільтрувального паперу і на нього наливають карболовий розчин генціану фіолетового на 0,5-1 хв. Потім знімають папір, наливають розчин Люголя на 0,5-1 хв., змивають розчин Люголя. Скло прополіскують в етиловому спирті протягом 0,5-1 хв., поки не перестане відходити фарба. Після чого скло ретельно промивають водою та забарвлюють фуксином Ціля, розбавленним 1:10 дистильованою водою, 1-2 хв. Після промивки і підсушування препарату мазок розглядають під мікроскопом.
При використанні набору для фарбування за Грамом промислового виробництва користуються інструкцією до набору.
6. Підготовка до аналізу
6.1. Підготовка посуду і матеріалів
Лабораторний посуд ретельно миють у водопровідній воді з домішкою нейтрального миючого засобу, промивають дистильованою водою до повного видалення миючих засобів та інших сторонніх речовин і висушують у сухожаровій шафі при 100 град. С.
Пробірки, колби, пляшки, флакони закривають металевими, силіконовими або ватно-марлевими пробками і покривають ковпачками з фольги чи щільного паперу. Пробірки щільно закривають пробками без ковпачків.
Нові гумові пробки кип'ятять в 2%-ому розчині натрію двовуглекислого 30 хв. і 5 разів промивають водопровідною водою (кип'ятіння та промивання повторюють 2 рази). Гумові пробки, які використовували раніше, після знезараження кип'ятять 30 хв. у водопровідній воді з нейтральним миючим засобом, промивають у дистильованій воді, висушують і зберігають до використання.
Чашки Петрі, піпетки, у верхню частину яких вставлена вата, укладають у металеві пенали або обгортають у крафт-папір.
Підготовлений посуд стерилізують у сушильній шафі при 160 град. С протягом 2 годин або при 180 град. С - 1 години або паром в автоклаві при (128 +- 1) град. С протягом 1 години з наступним підсушуванням в сушильній шафі в разі відсутності вакуумної сушки в автоклаві.
Матеріали і лабораторний посуд, які мають деталі, що руйнуються при 160 град. С (гума, ватно-марлеві пробки тощо), стерилізують у паровому стерилізаторі при температурі (128 +- 1) град. С 30 хв.
Стерильний посуд зберігають до використання в закритій шафі або ящиках не більше 7 днів за умови, що упаковка не порушена.
Після закінчення дослідження всі використані чашки, пробірки знезаражують у паровому стерилізаторі при (128 +- 1) град. С 60 хв. або при (132 +- 1) град. С 20 хв. Піпетки знезаражують в дезрозчинах або кип'ятінням у 2%-ому розчині NaHCO3 протягом 1 години.
Після охолодження видаляють залишки середовищ, потім чашки і пробірки замочують у водопровідній воді і миють з миючим засобом та наступним ополіскуванням дистильованою водою, як було вказано вище.
6.2. Підготовка проб води
Перед мікробіологічним дослідженням пробу ретельно перемішують. Край ємкості фламбують для запобігання можливого вторинного забруднення, яке може мати місце під час транспортування. На флаконах, пробірках і чашках, які використовуються для дослідження, позначають номер проби, об'єм, дату посіву. Перед кожним відбором нової порції води для аналізу зразок перемішують стерильною піпеткою.
Для фільтрації використовують мембранні фільтри діаметром від 35 до 50 мм з розмірами пор 0,45 мкм в стерильній та нестерильній упаковках.
Нестерильні фільтри стерилізують безпосередньо перед їх використанням: кип'ятінням або іншим способом, рекомендованим фірмою-виробником. Для кип'ятіння фільтри кладуть у склянку або медичний стерилізатор з дистильованою водою, нагрітою до 30 град. С, повільно доводять до кипіння на слабкому вогні, після чого воду міняють і кип'ятять 10 хвилин. Підготовлені фільтри використовуються протягом робочого дня.
6.3. Підготовка фільтрувального апарату
Лійку та столик фільтрувального апарату протирають ватним тампоном, змоченим спиртом, і стерилізують фламбуванням.
Після охолодження на нижню частину фільтрувального апарату (столик) кладуть стерильним пінцетом підготовлений мембранний фільтр, притискують його верхньою частиною приладу (лійкою), яку закріплюють пристроєм, передбаченим конструкцією приладу.
6.4. Методика фільтрування води
Перед проведенням дослідження перевіряють правильність складання фільтрувального апарату. Для цього в лійку фільтрувального апарату, дотримуючись правил стерильності, наливають необхідну кількість води і утворюють вакуум у приймальному посуді. Вода не повинна виливатися за межі фільтра або проникати через фільтр до утворення вакууму. Після цього можна починати досліджувати пробу води.
При посіві декількох об'ємів однієї проби слід фільтрувати через один фільтрувальний апарат спочатку менші, а потім більші об'єми води, замінюючи кожного разу фільтри. При фільтрації невеликих об'ємів води (1 куб. см) у лійку спочатку наливають 10 куб. см стерильної води, а потім вносять досліджувану пробу води. При відсутності мірних міток у лійці проби об'ємом 100 куб. см і більше відбирають стерильними піпетками Мора, а об'ємом 10 та 1 куб. см - стерильними піпетками.
Після закінчення фільтрування лійку знімають, фільтр обережно піднімають за край профламбованим пінцетом при зберіганні вакууму для видалення залишків вологи на нижній поверхні фільтру, а потім переносять його, не перевертаючи, на поверхню відповідного середовища, розлитого в чашки Петрі, запобігаючи утворенню пухирців повітря між фільтром і середовищем. Поверхня фільтру з бактеріями, які осіли на неї, повинна бути повернена вгору. Вакуум відключається до внесення наступної порції води, що досліджується.
Під кожним фільтром на дні чашки роблять напис із зазначенням об'єму профільтрованої води, дати посіву і номера проби. На одній чашці можна розмістити 2-4 фільтри за умови, що фільтри не торкаються один одного.
Якщо досліджувана вода має велику кількість завислих речовин чи клітин фітопланктону, то її попередньо фільтрують через передфільтр для видалення зависі великих розмірів. Для цього передфільтр розташовують у фільтрувальному апараті над фільтром для бактеріологічного аналізу. Після закінчення фільтрування два фільтри (передфільтр і фільтр) переносять на середовище. При підрахунку результатів аналізу враховують ріст бактерій на обох фільтрах.
6.5. Підготовка тест-культур мікроорганізмів
Культивування еталонних культур та підготовка до використання викладені у Додатку 2.
7. Визначення загального мікробного числа (ЗМЧ)
7.1. Принцип методу
Визначення ЗМЧ проводять методом глибинного посіву води у поживний агар і враховують усі колонії мікроорганізмів, які можна побачити при 2-5-кратному збільшенні, що виросли при температурі (36 +-1) град. С протягом (24 +- 2) годин чи при (22 +- 1) град. С протягом 48 годин в глибині та на поверхні поживного агару.
7.2. Порядок дослідження
Поживний 1,5%-ий агар (п. 5.2.4.) розтоплюють на водяній бані і охолоджують до температури (45 +- 5) град. С. Стерильні чашки Петрі підписують і розташовують на строго горизонтальній поверхні столу. Воду ретельно перемішують. З кожної проби води роблять посів не менше 2 об'ємів по 1 куб. см натуральної проби або з 10-кратних розведень у дві паралельні чашки.
Після внесення води в чашки Петрі в кожну з них заливають 10-12 куб. см охолодженого поживного агару і, обережно обертаючи, перемішують вміст чашки на поверхні столу, запобігаючи утворенню бульбашок повітря, неповному заповненню дна чашки агаром, попаданню середовища на краї та кришку чашки. Чашки залишають на горизонтальній поверхні до застигання середовища, потім перевертають дном догори і ставлять в термостат.
Посіви вирощують при (36 +- 1) град. С протягом (24 +- 2) годин. При необхідності - при (22 +- 1) град. С протягом (48 +- 2) годин. Чашки з посівами розташовують в термостаті таким чином, щоб відстань між чашками та стінками термостату була не менше 3 см.
При дослідженні води з джерела водопостачання, на етапах водопідготовки або з розподільчої мережі, де передбачається високе обсіменіння, підбирають для посіву такі дози води, щоб на чашці виросло не більше 300 колоній мікроорганізмів.
7.3. Обробка результатів.
Колонії, які виросли як на поверхні, так і в глибині агару, підраховують за допомогою лупи з 2-5-кратним збільшенням або за допомогою пристрою для підрахунку колоній.
При посіві 1 куб. см нерозведеної проби води враховують всі колонії, що виросли, але не більше 300.
Підраховують кількість колоній мікроорганізмів в кожному з паралельних посівів одного розведення. За результатами визначають середньоарифметичне значення числа колоній в посівах одного розведення або натуральної проби. При підрахунку враховують кратність розведення проб.
Результат виражають у колонієутворюючих одиницях (КУО) в 1 куб. см досліджуваної проби води і заносять до протоколу.
Результат видають на основі підрахунку колоній на одній чашці, якщо інший підрахунок неможливий (при повзучому рості бактерій, який покриває всю поверхню чашки). Якщо на всіх чашках має місце ріст розпливчастих колоній, який не розповсюджується на всю поверхню чашки, чи виросло більше 300 колоній і аналіз не можна повторити, підраховують сектор чашки з наступним перерахунком на всю поверхню. У таких випадках в протоколі відмічають "число КУО в 1 куб. см - орієнтовно". Якщо підрахунок колоній на чашках неможливий, то в протоколі відмічають "зливний ріст".
Якщо результат знаходиться в межах чисел від 1 до 100, то записують отримане число. Якщо результат знаходиться в межах чисел від 101 до 1000, то результат закругляють до 10. Якщо результат знаходиться в межах чисел від 1001 до 10000, то результат закругляють до 100 і т. д.
8. Визначення бактерій групи кишкових паличок
(коліформних бактерій)
Оскільки при дослідженні води на практиці не можливо вивчити всі важливі з точки зору диференційної діагностики ознаки для системного визначення мікроорганізмів, то у світовій практиці було розроблено сукупність окремих тестів, яка дозволяє спрощеним методом досягти надійного результату.
До бактерій групи кишкових паличок (БГКП) відносяться грамнегативні, що не утворюють спор, палички, які зброджують глюкозу з утворенням кислоти та газу при (36 +- 1) град. С протягом 24 годин і в яких відсутня оксидазна активність.
Поряд з цим, з загальної чисельності БГКП виділено наступні групи мікроорганізмів, які мають різне санітарно-показове значення:
- Лактозопозитивні коліформні бактерії - представники БГКП, які, крім вказаного вище, ферментують лактозу з утворенням кислоти та газу при 36 +- 1 град. С за 24-48 годин інкубації.
- Термотолерантні кишкові бактерії - мають ті ж ознаки, що і БГКП, але вони ферментують лактозу при 44 +- 0,5 град. С за 24-48 годин інкубації.
- Е. coli - мають ті ж ознаки, що і термотолерантні кишкові бактерії, але, крім того, вони утворюють індол з триптофану та не ростуть на цитратних середовищах.
Кількість бактерій групи кишкових паличок визначають методом мембранної фільтрації або титраційним методом (найбільш вірогідного числа - НВЧ).
Метод мембранної фільтрації полягає у фільтруванні певного об'єму води через мембранні фільтри, інкубації їх при (36 +- 1) град. С на середовищі Ендо, підрахунку кількості бактерій, що виросли, подальшій ідентифікації за культуральними та біохімічними властивостями та розрахунку індексу в 1 куб. дм води.
Суть титраційного методу полягає в посіві певних об'ємів води, що досліджується, в середовища накопичення (глюкозо-пептонне, лактозо-пептонне середовища), підрощуванні при (36 +- 1) град. С з подальшим висівом на середовище Ендо, ідентифікації бактерій, що виросли, та визначенні НВЧ БГКП в 1 куб. дм води за таблицями.
Обидва методи можуть застосовуватись, але кожен з них має свої переваги та недоліки.
Метод мембранної фільтрації дозволяє скоротити тривалість аналізу до 24-48 год., в залежності від ступеня чистоти досліджуваної води. Цей метод рекомендується для дослідження води на кінцевому етапі водопідготовки та води з розподільчої мережі при відсутності суттєвого вторинного мікробного обсіменіння в системі водопостачання.
Титраційний метод триває 48-72 годин і є більш затратним. Має переваги в разі дослідження води з високим рівнем гетеротрофної мікрофлори або завислих речовин та при великих дозах хлору або інших дезинфектантів. В останньому разі засів у середовище збагачення дозволяє мікроорганізмам вийти з стану сублетального стресу після дії дезинфектантів, що підвищує вірогідність отриманого результату.
8.1. Виконання методу мембранної фільтрації
Прилад для мембранної фільтрації та мембранні фільтри готують згідно з п.п. 6.3, 6.4. Техніка фільтрації описана у п. 6.5.
8.1.1. Дози посіву
Загальний об'єм водопровідної води, який повинен бути профільтрований, дорівнює 300 куб. см.
Окремі об'єми, які фільтрують через один фільтр, залежать від передбаченого ступеню обсіменіння води мікроорганізмами, але таким чином, щоб на одному з фільтрів виросло не більше 30 колоній бактерій групи кишкових паличок.
При дослідженні водопровідної води після повного комплексу очистки та знезараження, а також з розподільчої мережі фільтрують три об'єми по 100 куб. см. При наявності вторинного забруднення води в розподільчій мережі або при дослідженні води на етапах водопідготовки та води невідомої якості фільтрують менші об'єми (наприклад, 10; 40; 100; 150 куб. см).
В разі наявності водопровідної води стабільно високої якості можна фільтрувати 300 куб. см через один фільтр.
8.1.2. Порядок дослідження.
Після фільтрації кожен фільтр при збереженні вакууму для видалення надлишків вологи на нижній стороні фільтру профламбованим пінцетом переносять на середовище Ендо, виготовлене згідно з п. 5.2.5.1. При високому обсіменінні води сапрофітною мікрофлорою для попередження заростання фільтрів використовують середовище Ендо згідно з пп. 5.2.5.2., 5.2.5.3. Чашки з середовищем Ендо та фільтрами інкубують догори дном при (36 +- 1) град. С протягом (24 +- 2) год. На одну чашку можна помістити 3-4 фільтра за умови, щоб вони не торкалися.
Якщо на фільтрах ріст бактерій відсутній або виросли нетипові колонії (плівчасті, зморщені, губчасті з нерівними краями тощо), видають негативний результат - відсутність БГКП у досліджуваному об'ємі води.
При наявності на фільтрах колоній, характерних для БГКП (темно-червоних з металевим блиском чи без нього, рожевих з червоним центром, рожевих або блідо-рожевих, які дають відбиток зі зворотньої сторони фільтру або без нього - утворення або відсутність альдегіду), підраховують число колоній кожного типу.
Для подальшої ідентифікації відбирають не менше 3-4 колоній кожного типу. Ідентифікацію проводять за такою схемою:
- визначення оксидазної активності;
- мікроскопія препарату, фарбованого за Грамом;
- ферментація глюкози (визначення БГКП) або лактози (визначення ЛКБ, ТКБ та Е.coli) в залежності від мети дослідження.
Визначення оксидазної активності проводять згідно з п. 5.2.29. В разі відсутності ферменту оксидази готують мазок для мікроскопії, фарбують за Грамом (п. 5.2.32). При наявності в мазку грамнегативних поліморфних паличок, які не утворюють спор, визначають ферментативну активність досліджуваних колоній.
Для цього 3-4 колонії кожного типу засівають уколом в напіврідке середовище з глюкозою (п. 5.2.8), яке бажано підігріти до 37 град. С. Попередній облік можна проводити через 4-6 год. інкубації посівів при (36 +- 1) град. С. В разі наявності кислоти та газу результат вважається позитивним. В разі наявності тільки кислоти або відсутності зміни середовища посіви продовжують інкубувати до 24 год. При утворенні кислоти та газу результат вважається позитивним. При наявності тільки кислоти або відсутності зміни середовища результат вважається негативним.
Якщо колонії, що виросли на фільтрах, замалі за розміром, то їх пересівають на середовище Ендо так, щоб отримати ріст окремих колоній, і в подальшому досліджують, як описано вище.
При наявності зливного росту на фільтрі роблять розсів на середовище Ендо (п.п. 5.2.5.2 або 5.2.5.3) для отримання ізольованих колоній. В подальшому типові колонії досліджують відповідно до вище описаного. В такому разі результат вважається якісним.
При виявленні лактозопозитивних варіантів колоній (темно-червоні та червоні з металевим блиском або без нього, рожеві з червоним центром або іншого типу колонії з відбитком на зворотній стороні) проводиться і визначення їх належності до ТКБ.
Для цього 2-3 колонії кожного типу з кожного об'єму води засівають у напіврідке середовище з лактозою (п. 5.2.8), попередньо підігріте до 44 град. С. Посіви інкубують при (44 +- 0,5) град. С 24 год. При утворенні кислоти та газу через 24 год. інкубації результат вважається позитивним. При утворенні тільки кислоти інкубацію продовжують до 48 год. Якщо через 48 год. в середовищі не з'являються ознаки газоутворення, то досліджувана колонія не відноситься до ТКБ.
В окремих випадках необхідно визначити серед ТКБ наявність саме Е. coli. Для цього, крім термостабільного тесту, паралельно визначають здатність мікроорганізмів утворювати індол та відсутність росту на середовищі, де єдиним джерелом вуглецю є цитрат натрію. Для цього залишки колоній засівають на середовище Сімонса (п. 5.2.12), у бульйон з триптофаном (п. 5.2.11). В разі недостатньої кількості посівного матеріалу проводять його накопичення на скошеному агарі (термін дослідження подовжується на 1 добу).
Пробірки з триптофановим бульйоном та чашки з цитратним середовищем інкубують при (36 +- 1) град. С протягом 24 год. У пробірки з триптофановим бульйоном додають по краплям 0,5 куб. см реактиву Ерліха або Ковача (пп. 5.2.11.1-5.2.11.3).
Утилізація цитрату (позитивна реакція) встановлюється за наявністю росту мікроорганізмів та синього кольору середовища. При негативній реакції, характерній для Е. coli, ріст відсутній, колір середовища залишається незмінним.
При дослідженні джерела водопостачання у відповідності з існуючими нормативними вимогами в Україні визначають наявність загальних коліформних бактерій, тобто лактозопозитивних кишкових бактерій (ЛКБ). Для цього лактозопозитивні, оксидазонегативні, грамнегативні бактерії, виявлені на фільтрах, засівають у напіврідке середовище з лактозою, інкубують при (36 +- 1) град. С 24 год. і враховують ті колонії, які ферментують лактозу з утворенням кислоти та газу.
Примітка. При виявленні лактозонегативних оксидазонегативних грамнегативних паличок необхідно провести їх ідентифікацію з метою виявлення патогенних ентеробактерій.
При виявленні лактозонегативних, оксидазопозитивних, грамнегативних паличок необхідно провести дослідження з метою визначення холерного вібріона.
Відомчі лабораторії в разі виявлення означених колоній направляють посіви для подальшого вивчення до закладів державної санепідслужби.
8.1.3. Облік результатів
Результат виражають у вигляді індексу, тобто кількості БГКП в 1 куб. дм води.
Індекс БГКП вираховують у такий спосіб: кількість характерних колоній, що виросли в проаналізованому об'ємі води, множать на 1000 і ділять на цей об'єм води.
При відсутності на фільтрах БГКП їх індекс буде меншим тієї величини, що була б визначена у випадку виявлення в проаналізованому об'ємі однієї клітини цих бактерій.
Приклад 1. При посіві 300 куб. см води не виросло жодної колонії. (1 х 1000) : 300 = 3. Індекс БГКП менше 3.
При наявності бактерій групи кишкових паличок обчислюють колі-індекс з огляду на весь об'єм проаналізованої води.
Приклад 2. При посіві трьох об'ємів води по 100 куб. см на одному фільтрі виросло три колонії БГКП, на двох інших немає росту: колі-індекс дорівнює (3 х 1000) : 300 = 10.
При посіві 10 і 100 куб. см води на одному фільтрі виросла одна колонія, на іншому виросло п'ять колоній; індекс БГКП дорівнює (6 х 1000) : 110 = 54.
Якщо на одному з фільтрів спостерігається суцільний ріст бактерій і підрахунок їх неможливий, тоді в розрахунок беруть той об'єм води, при фільтруванні якого на фільтрі виросли ізольовані колонії.
Приклад 3. У 100 куб. см - суцільний ріст, у 10 куб. см - 12 кишкових бактерій; колі-індекс дорівнює (12 х 1000) : 10 = 1200.
При підрахунку індексу БГКП в пробах незнезараженої води з великим фекальним забрудненням, коли для аналізу профільтровують обсяг води, менший 10 куб. см, або її розведення, то для обліку вибирають той фільтр, на якому виросло не менше 10 і не більш 30 ізольованих колоній кишкових бактерій. Кількість на ньому колоній, які відносяться до БГКП, перераховують на 1 куб. дм з урахуванням тільки того об'єму води, який профільтровано через цей фільтр.
Якщо на всіх фільтрах отримано більш густий ріст і аналіз неможливо повторити, то допускається підрахунок колоній на фільтрі з найменшим розведенням, але з відповідним записом у протоколі дослідження та у журналі реєстрації.
Результат у вигляді індексу БГКП заносять до журналу реєстрації і до протоколу аналізу, де позначають особливі обставини, що мали місце при аналізі води (відхилення в температурі інкубації, складі середовищ, що використовувались, особливих добавок в середовищі Ендо тощо).
У разі необхідності індекси ТКБ та Е. coli вираховуються аналогічно.
8.2. Виконання титраційного методу
8.2.1. Дози посіву
Водопровідну питну воду після очистки та знезараження, а також з розподільчої системи засівають в об'ємі 333 куб. см (три об'єми по 100,0 куб. см, три об'єми по 10,0 куб. см та три об'єми по 1,0 куб. см). При наявності постійно високих результатів можна досліджувати три об'єми по 100,0 куб. см.
При контролі ефективності окремих етапів водопідготовки та якості води джерела водопостачання об'єми води зменшують в залежності від передбачуваного рівня мікробного забруднення так, щоб останній досліджуваний об'єм дав негативний результат (це можуть бути 100,0, 10,0, 1,0 та 0,1 куб. см води або 10,0, 1,0, 0,1 і 0,01 куб. см води).
8.2.2. Порядок дослідження
Дози води засівають у концентроване (п. 5.2.6.2) та нормальної концентрації (п. 5.2.6.1) глюкозо-пептонне середовище (ГПС) з поплавками. Дози 100,0 куб. см та 10,0 куб. см засівають у флакони з 10,0 куб. см і пробірки з 1,0 куб. см концентрованого середовища, дози 1,0 куб. см, 0,1 куб. см та менші - у пробірки з середовищем нормальної концентрації.
Для отримання об'ємів менших за 1,0 куб. см попередньо виконують послідовні десятикратні розведення, для чого 1,0 куб. см води додають у 9,0 куб. см фізіологічного розчину або деіонізованої водопровідної води і старанно перемішують. Отримано розведення 10-1 . З цього розведення 1,0 куб. см переносять в 9,0 куб. см фізіологічного розчину або деіонізованої води і т.д.).
Посіви інкубують при (36 +- 1) град. С 24 години. При обліку результатів відмічають наявність ознак росту мікроорганізмів: помутніння середовища або помутніння і утворення газу. Відсутность ознак росту через 24 години дозволяє отримати негативний результат - відсутність БГКП в об'ємі досліджуваної води.
При наявності росту з кожного флакона або пробірки, де відмічено помутніння, утворення кислоти або газу, роблять пересів на середовище Ендо (п. 5.2.5.1) так, щоб отримати ізольовані колонії (відсутність ізольованих колоній не дозволяє продовжувати аналіз і потребує розсіву для отримання росту ізольованих колоній).
Чашки з середовищем Ендо інкубують при (36 +- 1) град. С протягом 16-18 год.
При урахуванні результату пересіву з середовища накопичення на середовище Ендо можливі три основні варіанти:
- На чашках або окремих секторах відсутній ріст колоній або виросли нетипові для БГКП колонії (плівчасті, зморщені, губчасті з нерівними краями тощо). Відмічають відсутність БГКП в досліджуваному об'ємі води.
- На чашках або секторах Ендо виросли типові для БГКП колонії: темно-червоні та червоні з металевим блиском або без нього, рожеві з червоним центром і відбитком на середовищі, що вказує на ферментацію лактози і утворення альдегіду. Якщо ріст цих мікроорганізмів на середовищі накопичення супроводжувався утворенням кислоти та газу, то їх належність до БГКП підтверджують мікроскопією і постановкою оксидазного тесту. При виявленні оксидазонегативних, грамнегативних паличок, що утворюють кислоту і газ у середовищі накопичення з глюкозою, видають результат про виявлення БГКП.
- На секторах Ендо виросли колонії рожеві, блідо-рожеві з більш вираженим центром або без нього, а на середовищі накопичення відмічено помутніння, утворення газу або тільки помутніння. Колонії можуть відноситися до БГКП за наступними ознаками:
- відсутність ферменту оксидази;
- негативне забарвлення за Грамом;
- ферментація глюкози з утвореннями кислоти та газу при (36 +- 1) град. С.
Оксидазний тест виконують згідно з п. 5.2.30 з 2-3 колоніями кожного типу з кожного сектору. Колонії, які дали позитивний оксидазний тест, подальшому дослідженню на БГКП не підлягають - результат негативний.
З оксидазонегативних колоній кожного типу роблять мазки, забарвлюють за Грамом (п. 5.2.32) та розглядають під мікроскопом. Якщо в мазках виявлено грамнегативні палички, то для підтвердження необхідно виконати тест ферментації глюкози.
Колонії кожного типу засівають уколом в напіврідке середовище з глюкозою (п.п. 5.2.8, 5.2.9), яке попередньо бажано підігріти до 37 град. С. При цьому забирають як можна більше посівного матеріалу. Пробірки з посівами інкубують в термостаті при (36 +- 1) град. С 4-6 годин. При утворенні кислоти та газу дають позитивну відповідь. При відсутності чіткого росту або утворенні тільки кислоти продовжують інкубацію до 24 годин. Якщо виявлено тільки кислоту, то досліджувані колонії не належать до БГКП. Ферментація глюкози з утворенням кислоти та газу свідчить про наявність БГКП в досліджуваному об'ємі води.
При виявленні на середовищі Ендо лактозопозитивних, оксидазонегативних, грамнегативних паличок при необхідності проводять визначення належності їх до ТКБ або Е. coli згідно з п. 8.1.2.
При дослідженні джерела водопостачання враховують тільки лактозопозитивні варіанти (п. 8.1.2.).
Примітка. При розсіві зливного росту мікроорганізмів для отримання ізольованих колоній їх ідентифікацію виконують за схемою, як вказано вище.
В разі сумніву щодо належності колоній до БГКП, не дивлячись на утворення альдегіду та газу на середовищі накопичення, виконують тест на оксидазу, роблять мікроскопію та засівають у напіврідку глюкозу, якщо це питна вода, або у напіврідку лактозу, якщо це вода джерела водопостачання.
В разі необхідності для швидшого встановлення наявності у воді ТКБ допускається висів з пробірок з середовищем накопичення, де є ріст з утворенням газу, у напіврідку лактозу з подальшою інкубацією при (44 +- 1,0) град. С.
Інші варіанти дивись примітку до п. 8.1.2.
8.2.3. Облік результатів
Результат дослідження вираховується у вигляді індексу БГКП (найбільш вірогідне число БГКП в 1 куб. дм води), величину якого визначають за таблицею 1 Додатку 1.
Індекси ТКБ та Е. coli підраховують за тією ж таблицею.
9. Виявлення сальмонел
Сальмонели відносяться до числа найбільш розповсюджених і в той же час стійких до дії фізико-хімічних факторів мікроорганізмів - збудників гострих кишкових інфекцій, які поряд з іншими мають водний шлях передачі. На сьогодні ідентифіковано понад 2500 сероварів сальмонел, і не існує жодного рівноцінного методу виділення для всіх відомих сероварів.
Запропоновані у даних МВ методи є досить ефективними для виявлення багатьох циркулюючих у воді сероварів.
Як правило, сальмонели присутні у воді в низьких концентраціях. Тому бажано проводити їх попереднє концентрування, що дозволяє уникнути ускладнень при роботі з великими об'ємами води. Крім того, сальмонели у водному середовищі зазнають ушкодження, і для відновлення їх фізіологічної активності доцільно використовувати неселективне попереднє збагачення, щоб відбулося відновлення фізіологічної активності сальмонел, але не відбулося інтенсивного розмноження супутньої мікрофлори. Наступне селективне збагачення створює більш сприятливі умови для розвитку сальмонел у порівнянні із супутньою мікрофлорою, що підвищує результативність аналізу.
9.1. Визначення поняття показника
Сальмонели - це факультативно-анаеробні грамнегативні неспороутворюючі палички, добре ростуть на простих поживних середовищах, рухливі, крім S. gallinarum-pullorum. При ферментації глюкози утворюють газ за невеликим винятком (S. typhi, S. typhisuis та ін.), не ферментують лактозу та сахарозу, продукують сірководень. Ідентифікацію сальмонел проводять за рядом біохімічних тестів та по антигенній структурі, що виявляється в реакції аглютинації на склі з О- та Н- аглютинуючими сироватками.
9.2. Відбір проб
Проби відбирають і транспортують як описано вище (п. 3) в об'ємі 1-5 куб. дм у залежності від передбачуваної концентрації сальмонел у воді та методу визначення.
Допускається зберігати проби води при +(6 +- 2) град. С до 24 год.
9.3. Метод визначення
9.3.1. Принцип методу
Метод полягає в концентрації проб, накопиченні сальмонел у середовищі попереднього збагачення з наступним збагаченням в елективних рідких поживних середовищах, селекцією на двох різних диференційно-діагностичних поживних середовищах та ідентифікацією виділених мікроорганізмів за біохімічними і серологічними ознаками.
З метою підвищення результативності дослідження води на наявність сальмонел найчастіше викнують наступні послідовні методичні прийоми першого етапу дослідження:
- концентрування,
- попереднє збагачення,
- елективне збагачення.
9.3.2. Варіанти першого етапу дослідження
У залежності від рівня передбачуваного забруднення води, наявності устаткування для фільтрації води можливі такі варіанти першого етапу дослідження:
- фільтри без попереднього збагачення проби відразу поміщають у рідкі елективні поживні середовища. У цьому випадку 1 куб. дм води поділяють на два об'єми по 500 куб. см і кожен об'єм фільтрують через окремий фільтр.
- досліджувану воду безпосередньо засівають у середовище попереднього збагачення подвійної концентрації у співвідношенні 1:1 (п. 5.2.13).
- досліджувану воду об'ємом по 500 куб. см відразу засівають у елективні рідкі середовища подвійної концентрації.
У робочих журналах обов'язково відзначають, яким способом виконано перший етап дослідження.
Подальший перебіг дослідження вказаних варіантів - аналогічно п. 9.3.3.
9.3.3. Виконання методу концентрування
Концентрування сальмонел здійснюється методом мембранної фільтрації відповідно до п.п. 6.3-6.5.
Воду об'ємом не менше 1 куб. дм фільтрують через один-два фільтри у залежності від кількості завислих речовин. Для дуже каламутних вод використовують передфільтри.
Фільтри стерильним пінцетом переносять у 100 куб. см буферної пептонної води нормальної концентрації (п. 5.2.13) для попереднього збагачення. Інкубацію всіх фільтрів та передфільтрів однієї проби проводять разом.
Інкубація при (36 +- 1) град. С не більше 16 год.
По 1 куб. см збагаченої проби переносять у 10 куб. см елективних рідких середовищ нормальної концентрації - селенітовий бульйон (п. 5.2.14.1-5.2.14.2), магнієве середовище (п. 5.2.15.1-5.2.15.2), середовище Мюллера (п. 5.2.16). При цьому використовують не менше двох середовищ збагачення. Флакони з посівами інкубують при (36 +- 1) град. С протягом 16-24 год.
Після інкубації проводять висів на щільні диференційно-селективні середовища: чашки з вісмут-сульфіт агаром (п. 5.2.19), середовищами Ендо (п. 5.2.5.1), Плоскірева (п. 5.2.22), ксилозо-лізин-дезоксихолатним агаром, діамантово-зеленим агаром, SS-агаром тощо. При пересіванні на кожну пробу використовують не менше 2 чашок з селективними середовищами. Чашки із середовищами Ендо, Плоскірева, Мак-Конкі, ксилозо-лізин дезокси-холатним агаром, діамантово-зеленим агаром, SS-агаром інкубують при (36 +- 1) град. С протягом 24 год., із вісмут-сульфіт агаром за умов тієї ж температури - 48 год.
Після інкубації чашки переглядають і відзначають підозрілі на сальмонели колонії. На середовищах Ендо, Плоскірєва, Мак-Конкі, SS-агарі - це безбарвні або блідо-рожеві злегка опуклі блискучі колонії.
На ксилозо-лізин-дезоксихолатному агарі сальмонели утворюють колонії червоного або рожевого кольору з чорним центром. Сальмонели, які не продукують сірководень, наприклад S. typhi, S. senftenberg, S. pullorum, можуть рости у вигляді червоних колоній.
На діамантово-зеленому агарі колонії, типові для сальмонел, викликають зміну кольору агару на рожевий або червоний. Колір колоній може бути від рожево-сірого до червоного.
На вісмут-сульфіт агарі колонії сальмонел сіро-чорні з металевим блиском навкруги. Середовище під колонією набуває чорного забарвлення. Можливий ріст колоній з чорним центром і напівпрозорим краєм, а також невеликих плоских колоній темно-зеленого кольору. В міру старіння колоній з'являється піднятий центр і валик навколо центру.
Колонії сальмонел легко знімаються з агару, їм не властива слизувата або клейка консистенція.
З чашок відбирають по 2-3 підозрілі колонії кожного типу і засівають у пробірки з середовищем Олькеницького (п. 5.2.26) або Кліглера (п. 5.2.25). Штрихом засівають скошену частину і уколом - стовпчик.
Пробірки із середовищем Олькеницького або Кліглера інкубують при (36 +- 1) град. С протягом 24 год. Облік результатів проводять відповідно до ознак, наведених у таблиці 3 Додатку 1, які дозволяють зробити первинну ідентифікацію.
Якщо при первинному посіві і при висіві із середовищ збагачення підозрілих колоній не виявлено, може бути видана відповідь про негативний результат дослідження.
9.3.4. Концентрація проб методом осадження.
Концентрацію сальмонел у пробах води, що мають велику кількість завислих речовин, доцільно проводити методом осадження за допомогою розчину сульфату алюмінію. До проби води об'ємом 1-5 куб. дм при помішуванні вносять 20 куб. см на 1 куб. дм води 10%-ного розчину сірчанокислого алюмінію Al2(SO4)3 х 18 Н2 О. Після перемішування проби доводять рН води до 5,4-5,8, додаючи 0,1 N HCl. Пробу витримують 16-20 годин при (6 +- 2) град. С для випадіння осаду.
Рідину над осадом зливають, а осад із залишками води засівають у елективні середовища збагачення подвійної концентрації у співвідношенні 1:1. Подальший перебіг дослідження - аналогічно п. 9.3.3.
9.3.5. Біохімічне підтвердження наявності сальмонел
На середовищах Олькеницького або Кліглера оцінюють забарвлення та газоутворення. При рості сальмонел стовпчик забарвлюється в жовтий колір через ферментацію глюкози. Скошена частина середовища залишається блідо-рожевою при відсутності ферментації лактози, сахарози або обох вуглеводів. Газоутворення встановлюють по тріщинах та розривах у стовпчику агару. Утворення сірководню виявляють на основі почорніння середовища (від темної лінії по місцю проколу середовища до розлитого почорніння усього стовпчика). Гідроліз сечовини виявляється по відновленню рожевого кольору стовпчика середовища.
Культури, що не ферментують лактозу і не гідролізують сечовину, але ферментують глюкозу (з утворенням чи без утворення газу) та утворюють сірководень, підлягають подальшому вивченню.
Культури, що не ферментують лактозу, ферментують глюкозу без газоутворення, не утворюють сірководень і не гідролізують сечовину, підозрілі на S. paratyphi та Shigella. Їх випробовують реакцією аглютинації з полівалентними сальмонельозними та шигельозними сироватками, і подальше вивчення роблять в залежності від результату аглютинації.
Культури, що не ферментують лактозу, ферментують глюкозу з утворенням газу, не утворюють сірководню і є позитивними в реакції аглютинації з полівалентними сальмонельозними сироватками, можуть належати до роду Salmonella.
Усі підозрілі культури пересівають на поживні середовища мінімального диференційного ряду (таблиця 1) для підтвердження належності даної культури мікроорганізмів до роду Salmonella і проводять серологічну ідентифікацію.
Ферментативні властивості сальмонел різноманітні, при чому не тільки у окремих представників окремих підродів, але можуть змінюватись і в межах одного і того ж серовару. Вони звичайно утворюють сірководень і не утворюють індол, хоча іноді зустрічаються окремі серовари або їхні різновиди, які утворюють індол і не розкладають сечовину. Сальмонели, як правило, не ферментують лактозу, утилізують цитрат на середовищі Сімонса (S. typhi не утилізують).
Для сальмонел характерні також ферменти лізин-, орнітиндекарбоксилаза і аргініндегідролаза, хоча відомі штами S. typhimurium, S. enteritidis v. ratin та деякі інші серовари, які мають знижений вміст ферменту лізиндекарбоксилази або зовсім його не мають. Всі сальмонели дають позитивну реакцію з метиловим червоним (MR) і негативну реакцію Фогес-Проскауер (VP), редукують нітрати, ферментують маніт і глюкозу (з утворенням газу), але у таких серологічних типів як S. typhimurium, S. derby, S. thompson, S. enteritidis можуть зустрічатися і безгазові варіанти. Постійно не утворюють газу S. typhi і S. gallinarum. Не ферментують сахарозу і адоніт, хоча відомі випадки виділення штамів окремих сероварів, що ферментують сахарозу (S. newport, S. meleagridis, S. stenleyville та ін.). Майже всі сальмонели ферментують сорбіт і, як правило, не розріджують желатину.
Відношення сальмонел до арабінози, дульциту, інозиту, ксилози, рамнози, трегалози, гліцерину за Штерном, а також до d- та L-тартрату, цитрату і мукату неоднакове навіть у межах одного серологічного типу, що дозволяє підрозділяти їх на ряд стабільних біохімічних варіантів. Результати біохімічного типування використовуються в епідеміологічних дослідженнях.
Для прискорення досліджень, отримання відтворюваних результатів доцільно для біохімічної ідентифікації використовувати діагностичні системи та набори, що зареєстровані в Україні, типу ЕНТЕРОтест (PLIVA-Lachema), АРІ(bioMereux), системи індикаторні паперові (Росія).
Таблиця 1
Біохімічні властивості родів родини
Enterobacteriaceae, що зустрічаються найчастіше
------------------------------------------------------------------------------- |
Умовні позначення:
+ - позитивна реакція
- - негативна реакція
+,- - не постійно позитивна реакція
-,+ - негативна реакція, але деякими варіантами ферментується
X - різні типи реакції.
Крім наведених вище тестів ідентифікації виділених культур роблять також посів виділеної культури для дослідження її на чутливість до сальмонельозного О-бактеріофагу.
Для цього дві краплі 4-х або 18-годинної бульйонної культури досліджуваного штаму наносять тонко відтягнутою пастерівською піпеткою або петлею (діаметр 0,4-0,5 мм) на добре підсушений слабко лужний агар у чашці Петрі. Після підсихання на одну з крапель петлею або пастерівською піпеткою меншого діаметру наносять О-бактеріофаг, а на іншу, як контроль, - краплю бульйону. Фаг наносять у робочому розведенні, зазначеному на етикетці. На одній чашці, таким чином, можна випробувати одночасно 5-6 культур. Чашки з нанесеними культурами і О-бактеріофагом поміщають у термостат при (36 +- 1) град. С на 18-20 годин, після чого проводять облік результатів.
Поява на місці нанесення фагу чітко обмеженої зони зливного лізису або більшого чи меншого числа негативних колоній, чітко видимих неозброєним оком, свідчить про чутливість культур до О-бактеріофагу.
При відсутності лізису в місцях нанесення фагу буде суцільний ріст культури, як у контролі.
О-фаг може бути використаний для попереднього дослідження культури з чашки з диференційним середовищем.
Культура, що лізується О-фагом, є підозрілою на сальмонелу і може бути прямо з чашки випробувана в реакції аглютинації з полівалентними сальмонельозними О-сироватками.
Атипові сальмонельозні культури в більшості випадків чутливі до О-фагу, в той час як культури, подібні до сальмонел за біохімічними властивостями (наприклад, лактозонегативні Е. coli), як правило, не лізуються цим фагом.
9.3.6. Серологічне підтвердження сальмонел.
Сальмонели мають два основні антигенні комплекси, що представляють різні структурні частини бактеріальної клітини:
- соматичні - О-антигени - термостабільні, зберігаються при кип'ятінні культури протягом 2-5 годин;
- джгутикові - Н-антигени - термолабільні.
О-антигени являють собою складні фосфоліпідо-полісахаридні комплекси, структура яких вивчена досить повно.
Н-антигени мають білкову природу, можуть існувати у двох серологічних фазах: першій і другій (або "специфічній" та "неспецифічній").
Vi - термолабільний соматичний антиген, є одним із компонентів О-антигену і відноситься до групи К-антигенів. Він властивий трьом серологічним варіантам сальмонел - S. typhi, S. paratyphi С, S. dublin, а також зустрічається у деяких інших представників родини Enterobacteriaceae (Escherichia, Citrobacter).
Антигенна структура покладена в основу схеми Кауфмана-Уайта для ідентифікації серогруп і сероварів сальмонел, однак основними класифікаційними ознаками сальмонел, як і у всіх ентеробактерій, є біохімічні властивості, а не серологічна структура.
На підставі спільності будови О-антигенів сальмонели об'єднують в серологічні групи, які позначаються буквами латинського алфавіту (А, В, С, D, Е, F, Н та ін. до Z) і далі арабськими цифрами (від 51 до 67) і які містять серологічні типи, що відрізняються між собою структурою Н-антигенів.
В даний час схема Кауфмана-Уайта містить у собі 67 О-груп, що відрізняються різними комбінаціями понад 20 комплексів Н-антигенів першої фази і більш 10 різних комплексів Н-антигенів другої фази. Бактерії Arizonae включені до роду Salmonella, ідентифікація їх сероварів здійснюється за схемою Кауфмана-Уайта.
Серологічну ідентифікацію сальмонел починають з випробовування їх у реакції аглютинації на склі з полівалентною сироваткою ABCDE, що включає в себе аглютиніни до О-антигенів 2, 4, 61, 62, 7, 8, 9 і 3-10, 12, Vi.
Для цього на предметне скло поміщають краплю ізотонічного розчину хлористого натрію і поряд краплю полівалентної аглютинуючої сальмонельозної сироватки. Потім в кожну з крапель, починаючи з ізотонічного розчину, вносять бактеріологічною петлею культуру, рівномірно розтирають, похитуючи предметним склом протягом 30-60 сек.
Скло поміщають на темне поле і розглядають за допомогою лупи. При позитивній реакції аглютинації через 0,5-2,0 хв. в краплі сироватки утворюються пластівці, рідина просвітлюється. В краплі з ізотонічним розчином залишається рівномірне помутніння.
При відсутності реакції аглютинації з зазначеною сироваткою культуру випробовують з полівалентною до рідких груп сальмонел сироваткою, що включає антитіла до антигенів 11, 13-22, 14-34, 15, 19, 23 тощо.
При одержанні позитивних результатів аглютинації з однією з полівалентних сироваток культуру випробовують з кожною з О-сироваток, що входять до її складу окремо, для визначення належності її до однієї з О-груп.
Після встановлення належності культури до зазначеної О-групи її випробовують з Н-сироватками спочатку першої фази, а потім - другої. Починати слід з Н-сироваток, що відповідають більш розповсюдженим серологічним типам сальмонел даної групи.
Після визначення Н-антигену першої фази визначають Н-антигенні компоненти другої фази і у такий спосіб встановлюють антигенну формулу виділеної культури, тобто її серологічний варіант. При позитивному результаті реакції аглютинації виділеної культури з відповідними сироватками можна видати попередню відповідь про вид сальмонел.
Для аглютинації з О-сироваткою культуру варто брати з верхньої частини росту на скошеному агарі, для аглютинації з Н-сироватками - з найнижчої частини росту культури чи з конденсату, де розташовуються мікроорганізми з найбільш розвинутим Н-антигеном.
9.3.7. Обробка результатів.
Результати оцінюють по кожній пробі окремо. Штами, що дають типові біохімічні властивості та позитивні серологічні реакції з полівалентною аглютинуючою сальмонельозною сироваткою, відносяться до сальмонел. Позитивні реакції аглютинації з О- та Н-сальмонельозними сироватками дозволяють встановити антигенну формулу виділеної культури, тобто її серологічний варіант.
10. Визначення шигел
Шигели - збудники гострих кишкових інфекцій, які можуть розповсюджуватися водним шляхом та виживати у водному середовищі. На відміну від сальмонел їм притаманна менша стійкість до дії фізико-хімічних факторів, що ускладнює розробку селективних середовищ накопичення, яке необхідне внаслідок низької концентрації шигел у навколишньому середовищі. Тому при їх виділенні використовують ті ж методичні підходи, що і при дослідженні наявності у воді сальмонел, з різницею у використанні середовищ.
10.1. Визначення поняття
Шигели - факультативно-анаеробні грамнегативні, неспороутворюючі палички, нерухомі, ферментують глюкозу без газу (за деяким винятком), як правило, не ферментують лактозу та сахарозу, не продукують сірководень. Ідентифікацію шигел проводять за рядом біохімічних тестів та серологічних реакцій.
10.2. Відбір проб
Проби відбирають і транспортують згідно з вимогами п. 3 в об'ємі 1-5 куб. дм у залежності від передбачуваної концентрації шигел у воді.
10.3. Метод визначення
Метод визначення шигел полягає у концентрації проб чи накопиченні шигел на середовищах збагачення, висіві на диференційно-селективні середовища з подальшою ідентифікацією виділених мікроорганізмів за біохімічними та серологічними характеристиками.
При дослідженні води можлива комбінація декількох методичних прийомів:
- безпосередній посів води у середовища накопичення;
- концентрація шигел методом мембранної фільтрації з наступним збагаченням у середовищі накопичення;
- попереднє збагачення та селекція у середовищах накопичення за методом Ростовського-на-Дону НДІаЕМТ.
10.3.1. Безпосередній посів води у середовища накопичення
Пробу води ділять на два об'єми по 500 куб. см. В кожний об'єм вносять відповідне накопичувальне середовище: 500 куб. см селенітового бульйону подвійної концентрації (п. 5.2.14) та середовище з охміленим суслом (п. 5.2.17) або жовчний бульйон (п. 5.2.18). Інкубація при (36 +- 1) град. С протягом 18-24 год. Після цього з кожного флакону роблять висів на дві чашки з диференційно-селективними середовищами - агар ЕМС, агар Плоскірєва з антибіотиками (п. 5.2.24.) та без них (п.п. 5.2.23, 5.2.22.), середовище Мак-Конкі, SS-агар. Чашки з посівами інкубують при (36 +- 1) град. С протягом 18-24 год. При відсутності росту чашки з посівами залишають у термостаті ще на 24 год.
На вказаних середовищах шигели ростуть у вигляді прозорих або напівпрозорих безкольорових або трохи забарвлених невеликих круглих колоній, які дещо підвищені над поверхнею агару, мають рівні краї, блискучу поверхню. Вони легко знімаються з агару і мають м'яку консистенцію. При дисоціації культур можуть одночасно знаходитися колонії гладкої, шорсткої та перехідної форми. Колонії шигел Зоне бувають іноді великі, білуваті, а через 48 год. можуть набувати злегка рожевого відтінку.
По 2-3 колонії кожного типу з підозрою на шигели засівають у пробірки з середовищем Олькеницького (п. 5.2.26.) або Кліглера (п. 5.2.25.). Інкубують при (36 +- 1) град. С протягом 18-24 год. Облік результатів проводять відповідно до ознак, наведених у табл. 3 Додатку 1.
Для подальшого вивчення відбирають культури грамнегативних безспорових паличок з характерними властивостями для шигел, а саме: не розщеплюють лактозу і сечовину, не утворюють сірководню, ферментують глюкозу з утворенням кислоти і без газу. Варто враховувати, що серед S. sonnei зустрічаються біохімічні варіанти, що ферментують лактозу до кислоти, а деякі варіанти S. flexneri VI розщеплюють глюкозу до кислоти і газу.
Для остаточної ідентифікації культури засівають на мінімальний диференційний ряд (таблиця 2).
Таблиця 2
Біохімічні властивості шигел різних видів
------------------------------------------------------------------ |
Умовні позначення:
+ - ферментація середовища
- - середовище не ферментується
+,- - середовище ферментується, деякими варіантами не ферментується
-,+ - середовище не ферментується, деякими варіантами ферментується
X - варіанти стосовно даної ознаки.
Для прискорення досліджень, отримання відтворюваних результатів для біохімічної ідентифікації використовуються діагностичні системи та набори, зареєстровані в Україні, типу ЕНТЕРОтест (PLIVA-Lachema), АРІ (bioMereux) та системи індикаторні паперові (Росія).
Поряд з встановленням біохімічних властивостей проводиться серологічна ідентифікація шигел, заснована на вивченні їх антигенної структури шляхом виявлення типових і групових антигенів.
Культури, підозрілі як шигели, досліджують у реакції аглютинації на склі спочатку із полівалентною сироваткою S. flexneri I-VI, S. sonnei, а у випадку негативної реакції - з набором полівалентних сироваток до S. boydii, S. dysenteriae. При позитивній реакції аглютинації на склі однієї з полівалентних сироваток продовжують серологічну ідентифікацію культури з адсорбованими сироватками, що входять у полівалентну. При позитивному результаті аглютинацій з монорецепторними сироватками можна видати попередню відповідь про наявність у пробі води шигел.
Додатково доцільно досліджувати чутливість виділених культур до полівалентного дизентерійного бактеріофагу. Для цього використовують таку методику: на добре підсушену чашку зі слабко лужним агаром (рН 7,6) наносять пастерівською піпеткою краплю змиву 18-20-и годинної агарової культури. На підсохлі краплі відтягнутою пастерівською піпеткою наносять дизентерійний бактеріофаг; після підсушування чашки інкубують при 36 +- 1 град. С протягом 18-20 годин. При позитивному результаті спостерігається затримка росту культури на чашках з бактеріофагом.
Відповідь про наявність або відсутність шигел у пробі води дають за біохімічними та серологічними властивостями - за антигенною формулою та чутливістю до полівалентного дизентерійного бактеріофагу.
Для остаточної відповіді, що підтверджує не тільки виділення шигел із досліджуваної води, але й загальне джерело зараження та шляхи передачі інфекції, потрібне більш поглиблене вивчення виділених штамів з використанням методів внутрішньовидового типування. Для цього виділені культури шигел піддають більш детальному біохімічному вивченню, що дозволяє здійснити подальшу диференціацію збудника всередині серологічних типів і, крім того, використовують методи, засновані на феномені коліциногенії, а також визначення антибіотикограм.
10.3.2. Концентрація шигел методом мембранної фільтрації
Воду об'ємом 1 куб. дм ділять на два об'єми по 500 куб. см і кожний з них фільтрують через мембранний фільтр за п.п. 6.3.-6.5.
Один з фільтрів розміщують у 10 куб. см селенітового бульйону звичайної концентрації (п. 5.2.14), другий - у 10 куб. см середовища з охміленим суслом (п. 5.2.17).або жовчним бульйоном (п. 5.2.18).
Посіви інкубують при (36 +- 1) град. С протягом 18-24 год. В подальшому досліджують як вказано у п. 10.3.1.
10.3.3. Посів води за методом Ростовського-на-Дону НДІ ЕМГ (за Р.С. Хомик та А.А. Риндич)
До 1 куб. дм досліджуваної води додають 5-10 куб. см 1%-го МПБ та інкубують при (36 +- 1) град. С протягом 18-24 год. Роблять висів на середовища Ендо, ЕМС-агар, агар Плоскірєва (п.п. 5.2.5., 5.2.22., 5.2.23), середовище Мак Конкі, SS-агар. У той же час проводять посів збагаченої проби в селективні середовища накопичення: 10%-ий жовчний бульйон (п. 5.2.18) та селенітовий бульйон (п. 5.2.14) таким чином:
- беруть 1 куб. см збагаченої проби на 9 куб. см середовища накопичення і роблять ряд послідовних розведень до 10-5. З отриманих розведень роблять висів на два диференційно-селективних середовища: Ендо, ЕМС-агар, агар Плоскірєва, середовище Мак Конкі, SS-агар (по 0,1 куб. см на кожну чашку). Посіви на твердих середовищах і розбавлення у селективних середовищах інкубують при (36 +- 1) град. С протягом 18-24 год.
Після інкубації передивляють ріст на чашках та роблять висів з розведень на два диференційно-селективних середовища. Подальше дослідження проводять, як вказано у п. 10.3.1.
11. Визначення холерних вібріонів
(якісний метод)
Водопровідна вода підлягає бактеріологічному дослідженню на холерні вібріони при наявності епідеміологічних показань.
Бактеріологічні дослідження на наявність холерних вібріонів 01 та не 01 проводяться паралельно, в тих же самих пробах. Особливостями холерних вібріонів є відносно швидкий ріст в пептонній воді та здатність до розмноження в середовищах з високою лужністю (рН 9,5).
11.1. Визначення поняття показника
Холерні вібріони 01 - мікроорганізми, що на щільних середовищах утворюють типові колонії, проявляють відповідні біохімічні властивості та аглютинують з холерними діагностичними сироватками (01, R0, 0139), чутливі до холерних фагів (ельтор, класичний).
Холерні вібріони не 01 - мікроорганізми, що за морфологічними, культуральними та біохімічними властивостями аналогічні збуднику холери, але не аглютинують з холерними сироватками, не чутливі до холерних фагів.
11.2. Відбір проб
Проби відбирають і транспортують як описано вище (п. 3) в двох об'ємах по 500 куб. см.
11.3. Метод визначення
Метод полягає у накопиченні холерних вібріонів у двох послідовних середовищах збагачення, висіві на пластини лужного агару, пересіві характерних колоній на диференціальні середовища з подальшою ідентифікацією виділених мікроорганізмів за біохімічними, серологічними ознаками та фаголізабельністю.
11.3.1. Порядок дослідження
В залежності від часу доставки проби можливі декілька варіантів посівів з метою накопичення вібріонів.
1. У досліджувану воду (в двох об'ємах по 500 куб. см) додають розчин основного пептону до 1%-ої концентрації (п.п. 5.2.20.1-5.2.20.2). Визначають рН, у випадку необхідності підлужують 10%-им розчином їдкого натрію до рН (8,3 +- 0,1). Час інкубації - 8-10 год. У друге середовище збагачення (п. 5.2.20.3) в об'ємі 10 куб. см пересівають пробу з першого середовища збагачення. Час інкубації при рН (7,8 +- 0,2) без телуриту калію - 5-6 год., з підвищеною лужністю або з телуритом калію - 14-20 год.
2. В досліджувану воду (в двох об'ємах по 500 куб. см) додають розчин основного пептону до 1% концентрації (п. 5.2.20.1), встановлюють рН (9,3 +- 0,2) або додають телурит калію (п. 5.2.20.3) до концентрації 1:100000 або 1:200000 при рН (8,3 +- 0,1). Час інкубації 18-24 год. Друге середовище збагачення - 10 куб. см 1%-ої пептонної води, рН (7,8 +- 0,2) без телуриту калію, час інкубації 6-8 год.
3. Після встановлення лужної реакції і додавання розчину основного пептону до 1% концентрації проби зберігають при кімнатній температурі до ранку. На початку наступного дня 5 куб. см поверхневого шару засівають в 100 куб. см 1%-ої пептонної води (друге середовище збагачення) і роблять висів на лужний агар (п. 5.2.21). Висів з другого середовища збагачення - через 6 год.
4. Воду фільтрують через мембранні фільтр з діаметром пор 0,45 мкм, змив з яких засівають у середовище збагачення та на агарові пластинки.
I-ий етап
Висів на перше середовище збагачення (4 варіанти).
II-ий етап
Висів з першого середовища збагачення на пластини лужного агару і в друге середовище збагачення (4 варіанти).
III-ій етап
Висів з другого середовища збагачення на пластини лужного агару через 5-6 год. при рН (7,8 +- 0,2) і через 14-20 год. при рН (9,3 +- 0,2).
IV-ий етап
Відбір підозрілих колоній з твердих поживних середовищ проводиться через 16-24 год. інкубації. Переглядають чашки з посівами в прохідному світлі неозброєним оком, за допомогою лупи, можливо під стереоскопічним мікроскопом в косопрохідному світлі.
Колонії холерних вібріонів у типовій S-формі на лужному агарі - круглі, гладкі, плоскі, голубуваті, гомогенні з рівними краями, прозорі в прохідному світлі і сіро-голубі під стереоскопічним мікроскопом. Розміри колоній через 10-12 год. інкубації не перевищують 1 мм, а через 18-24 год. досягають 2-3 мм в діаметрі.
При відборі колоній можна використовувати пробу на наявність оксидази (п. 5.2.30).
Оксидазопозитивні колонії перевіряють в реакції аглютинації на склі з холерними діагностичними сироватками (01, R0, 0139) в розведенні 1:100. При позитивній реакції та достатній кількості підозрілих колоній ставлять слайд-аглютинацію з варіантоспецифічними сироватками Інаба і Огава в розведенні 1:50, готують мазки за Грамом (п. 5.2.32).
Позитивна орієнтовна реакція аглютинації з холерною 01 або R0 сироватками в розведенні 1:100 і варіантноспецифічними Інаба і Огава в розведенні 1:50 в поєднанні з морфологічними, культуральними ознаками і специфічною мобілізацією дозволяють видати на цьому етапі попередню відповідь щодо наявності в досліджуваній воді холерного вібріону 01.
Підозрілі на вібріони колонії висівають на одне з полівуглеводних середовищ (Олькеницького, Ресселя, Кліглера (п.п. 5.2.25, 5.2.26, 5.2.27) та на лужний агар для виділення чистої культури та ідентифікації.
V-ий етап
Відбирають культури з типовим для вібріонів характером росту на полівуглеводних середовищах.
Культури, що виросли на лужному агарі, перевіряють на наявність оксидази. Визначають морфологію та чистоту культур, що виросли на лужному агарі та полівуглеводних середовищах, за допомогою мазків, забарвлених за Грамом.
Культури, які дали характерні зміни на полівуглеводних середовищах, позитивні в пробі на оксидазу, перевіряють в слайд-аглютинації з холерними сироватками 01, R0, Інаба і Огава. При негативних результатах ставлять слайд-аглютинацію з холерною сироваткою 0139. При позитивних результатах культура терміново направляється до лабораторії відділу особливо небезпечних інфекцій санепідстанції, де проводиться розширена ідентифікація (люмінесцентна мікроскопія, фаголізабельність, наявність гемаглютинації тощо).
VI-ий етап
Враховують результати ідентифікації і видають остаточну відповідь щодо виділення культури холерного вібріону відповідної серогрупи: 01, R0 (Інаба, Огава, Гікошима) або 0139 з визначенням гемолітичної активності і чутливості до антибіотиків. Для культур холерних вібрінів 01 вказують належність до біовару (ельтор, класичний).
При виділенні культури холерного вібріону, яка не аглютинує з холерними сироватками, видають відповідь про виділення холерного вібріону не 01.
11.3.2. Облік результатів
До виду V. cholerae відносять грамнегативні, аспорогенні, поліморфні палички, злегка зігнуті або прямі, активно рухливі, що утворюють оксидазу, ферментують глюкозу в аеробних і анаеробних умовах до кислоти (без газу), декарбоксилізують лізин та орнітин, не мають гідролази аргініну, відносяться до 1-ої (рідше до 2-ої) ферментативної групи по Хейбергу.
Збудником холери є V. cholerae серогрупи 01 (біовари ельтор, класичний; серовари Інаба, Огава, Гікошима) і серогрупи 0139. Токсигенні варіанти холерних вібріонів 01, не 01 та 0139 серогруп викликають захворювання холерою (не 01 - холероподібні), які схильні до широкого епідемічного розповсюдження.
11.3.3. Організація лабораторних досліджень на холеру
Збудник холери відноситься до мікроорганізмів II-ої групи патогенності. Враховуючи особливості лабораторної діагностики та протиепідемічного режиму, лабораторії, що проводять дослідження на холеру питної води та іншого матеріалу, розподіляються за рівнем досліджень:
1-ий рівень - районні, міські лабораторії санепідслужби.
Можуть проводити дослідження на холеру у відповідності з нормативними документами за умов дотримання вимог протиепідемічного режиму роботи з мікроорганізмами III-ої групи патогенності та наявності дозволу на цю роботу.
Проводять лабораторні дослідження до встановлення негативного результату або виділення культури з характерним для вібріонів ростом на агарових та полівуглеводних середовищах, з позитивною реакцією на оксидазу. Культуру перевіряють в реакції слайд-аглютинації з холерними сироватками 01, R0 та 0139 в концентрації 1:100 та типоспецифічними сироватками Інаба, Огава в концентрації 1:50.
При позитивному результаті лабораторії терміново повідомляють територіальні санітарно-епідеміологічні станції про це. Культуру негайно направляють в лабораторії особливо небезпечних інфекцій Кримської республіканської, обласних, міських санепідстанцій для остаточної ідентифікації.
При негативному результаті слайд-аглютинації культуру ідентифікують за основними біохімічними ознаками: ферментація лактози, сахарози, манози, арабінози, інозиту, крохмалю, наявність декарбоксилази лізину, дигідролази аргініну, окислення та ферментації глюкози на середовищі Хью-Лейфсона.
2-ий рівень - лабораторії відділів особливо небезпечних інфекцій Кримської республіканської, обласних та міських санепідстанцій.
Проводять дослідження на холеру за умов дотримання вимог протиепідемічного режиму роботи з мікроорганізмами II-ої групи патогенності та при наявності дозволу на цю роботу:
- повне дослідження на холеру питної води при наявності епідеміологічних показань;
- ідентифікацію культур вібріонів (розширену), виділених в територіальних та відомчих лабораторіях області, додатково до обсягу робіт 1 рівня проводять: окислення маніту, саліцину, наявність декарбоксилази орнітіну, здатність росту на 1%-ій пептонній воді з 5% хлориду натрію, протеолітичні властивості, утворення індолу, сірководню, реакція MR, наявність уреази, а також чутливість до фагів (ельтор, класичний), ДДФ, ХДФ-3,4,5, наявність гемаглютинації, чутливість до поліміксіну (30 од.), утворення ацетилметилкарбінолу, люмінесцентна мікроскопія. В результаті визначають таксономічну належність до роду, виду, біовару, вірулентність та токсигенність, чутливість до антибіотиків;
- бактеріологічний контроль якості поживних середовищ;
- передачу в установленому порядку культур холерних вібріонів 01.
3-ій рівень - бактеріологічні лабораторії протичумних установ та лабораторія особливо небезпечних інфекцій Центральної санепідстанції МОЗ України:
- підтверджують таксономічну належність культур;
- вивчають особливості біологічних властивостей холерних вібріонів;
- визначають вірулентність та токсигенність штамів;
- проводять бактеріологічний контроль якості поживних середовищ у встановленому порядку;
- проводять моніторинг біологічних характеристик культур холерних вібріонів.
12. Визначення коліфагів
З багаточисельної групи фагів як санітарно-показових вірусів були вибрані постійно наявні у кишечнику людини та водних об'єктах соматичні коліфаги. Соматичні коліфаги - це бактеріальні віруси, котрі складаються з капсиду, який вміщує одно- або двониткову ДНК в якості геному. Соматичні коліфаги здатні інфікувати певні штами хазяїна Е. coli та утворювати видимі бляшки (зони лізису, прозорі зони) різного розміру та морфології на зливному газоні бактеріального росту хазяїна за відповідних умов культивування.
Визначення коліфагів можна проводити двома методами:
- титраційним методом (метод накопичення, НВЧ);
- прямим методом у 2-х варіантах.
Титраційний метод дозволяє виявляти незначну кількість коліфагів в об'єкті. Найчастіше застосовується при дослідженні питної води після очистки та знезараження, а також води з розподільчої системи або інших малозабруднених об'єктів. Отримання результату можливе через 24-48 годин.
Застосування прямого методу визначення коліфагів у питній воді має технічну обмеженість внаслідок неможливості дослідження великих об'ємів. Пропонуються два варіанти методу. Варіант I доречно застосовувати при ускладненні епідситуації, коли необхідно якнайшвидше отримати результат. Варіант II застосовують при дослідженні води джерел водопостачання. Прямий метод дозволяє отримати результат через 6-24 годин.
12.1. Титраційний метод визначення коліфагів
Принцип методу визначення коліфагів у питній воді полягає у накопиченні їх у рідкому середовищі збагачення при наявності сприятливих умов та наступному виявленні зон лізису газону Е. coli на поживному агарі.
Метод має декілька складових:
- приготування тест-культури хазяїна;
- посів об'ємів води, що досліджуються, у середовище накопичення з тест-культурою хазяїна;
- контроль можливої контамінації фагом середовищ і матеріалів, що використовуються (негативний контроль);
- контроль чутливості тест-культури хазяїна до соматичних коліфагів (позитивний контроль).
Як тест-культуру хазяїна соматичних коліфагів застосовують музейні штами Е. coli С або Е. coli В, які є більш чутливими до циркулюючих у водних об'єктах соматичних бактеріофагів.
12.1.1. Приготування посівної тест-культури Е. coli
Щоразу перед проведенням аналізу необхідно отримати свіжу посівну культуру Е. coli, що виконують так: робочу культуру, яку зберігають у холодильнику на агаровому косяку або стовпчику, засівають у 2 пробірки з 10 куб. см МПБ (п. 5.2.2) (найшвидший ріст культури можна отримати, якщо попередньо нагріти МПБ до (36 +- 1) град. С), інкубують протягом (5 +- 1) год. при (36 +- 1) град. С, по можливості легко струшуючи. Найкраще при аналізі використовувати 4-6 годинну культуру, але можна, при необхідності, брати у дослід і "нічну", тобто 18-годинну. Концентрація клітин Е. coli повинна бути не менше 8 10 клітин/куб. см, що визначають візуально (вигляд молока).
12.1.2. Проведення аналізу
При використанні титраційного методу досліджують такі об'єми води: 500, 200, 100, 50 та 20 куб. см, в які додають концентроване середовище накопичення (п. 5.3.2) в кількості 5% від загального об'єму та 4-18-годинну посівну бульйонну культуру Е. coli (п. 12.1.1) в кількості 1% від загального об'єму засіяної проби (5 куб. см, 2 куб. см, 1 куб. см, 0,5 та 0,2 куб. см відповідно). Після (16 +- 2) годинної інкубації при (37 +- 1) град. С визначають бактеріофаги двошаровим агаровим методом.
Попередньо розливають у 5 стерильних чашок Петрі по 15-20 куб. см 2%-го МПА (п. 5.2.4.2), витримують до повного застигання агару, та у 5 стерильних пробірок по 5 куб. см розплавленого 1,0%-го МПА (п. 5.2.4.2), який має бути охолоджений до температури (45 +- 5) град. С. В кожну з пробірок з 1,0%-им МПА вносять по 5 куб. см відповідного збагаченого об'єму проби води та по 0,5 куб. см Е. coli (п. 12.1.1). Обережно перемішують вміст пробірок, уникаючи утворення бульбашок повітря, і виливають на поверхню 2%-го МПА. Агар рівномірно розподіляють і залишають до застигання на горизонтальній прохолодній поверхні. Підсушують чашки з частково відкритими кришками, після чого їх закривають та інкубують у положенні вверх дном (не складають більше, ніж 6 чашок) при (36 +- 1) град. С протягом (4 +- 2) годин, після чого чашки з посівами виймають з термостату і залишають у темному місці при кімнатній температурі на (18 +- 2) години. Цей прийом запобігає негативному впливу на облік результатів супутньої мікрофлори.
12.1.3. Облік результатів
Перегляд результатів виконують у прохідному світлі. Облік проводять ретельно, фіксуючи появу хоча б на одній з чашок зон лізису. Кількість коліфагів в 1 куб. дм проби отримують, користуючись таблицею 2 Додатку 1.
Досліджувати всі об'єми води необхідно при первинному аналізі ще недосліджуваних проб, наявності нестабільних результатів або при введенні нових технологій на станціях водопідготовки. При стабільній роботі споруд водопідготовки з метою економії часу, посуду та поживних середовищ у поточних дослідженнях допускається досліджувати два об'єми води по 500 куб. см. У цьому разі дослідження є якісним.
12.1.4. Постановка негативного контролю.
Негативний контроль підтверджує відсутність контамінації фагом поживних середовищ, лабораторного посуду, устаткування на етапах підготовки та проведення аналізу, а також дозволяє підтвердити здатність Е. coli давати рівномірний повноцінний газон.
Негативним контролем слугує дослідження стерильної водопровідної води, яке проводиться аналогічно аналізу проби води. При застосуванні титраційного методу додатково аналізують 20 куб. см стерильної водопровідної води, а при дослідженні прямим методом - 5 куб. см.
У випадку виявлення зон лізису на чашках з негативним контролем результати дослідження даної серії проб вважаються недійсними. Необхідно перевірити стерильність поживних середовищ, лабораторного посуду, устаткування та культуру хазяїна за п. 1.5.4. Додатку 2.
Кратність проведення негативного контролю - 1 раз на день.
12.1.5. Постановка позитивного контролю.
Див. п. 1.5.3. Додатку 2.
12.1.6. Підтвердження фагової природи лізісу
У сумнівних випадках при роботі як титраційним, так і прямим методом проводять контрольний висів для підтвердження фагової природи лізісу.
З цією метою бактеріологічною петлею виймають ділянку агару, на якій є колонії підозрілі на фаги, вносять її у 5 куб. см МПБ (п. 5.2.2.), куди додають 0,5 куб. см тест-культури Е. coli (п. 12.1.1) та інкубують при (37 +- 1) град. С протягом (18 +- 2) годин. Отриману культуру досліджують на присутність коліфагів методом, вказаним у п. 12.3.1 (в якості дози посіву замість 5 куб. см використовують 1 куб. см).
12.2. Визначення коліфагів прямим методом (I-ий варіант)
Принцип прямого визначення коліфагів полягає в дослідженні 100 куб. см проби питної води шляхом його прямого посіву одношаровим агаровим методом і наступного підрахунку зон лізісу на газоні Е. coli.
Метод складається з наступних складових:
- приготування тест-культури хазяїна;
- посів об'єму води, який досліджується, на поживний агар з тест-культурою хазяїна;
- контроль можливої контамінації фагом середовищ і матеріалів, які використовуються (негативний контроль);
- контроль чутливості тест-культури хазяїна до соматичних коліфагів (позитивний контроль).
12.2.1. Проведення аналізу
Флакон зі 100 куб. см 2%-го МПА (п. 5.2.4.2) розтоплюють і доводять до 48 град. С на водяній бані. Досліджувану пробу води у кількості 100 куб. см виливають у відповідний стерильний скляний посуд (наприклад, медичний флакон об'ємом 200 куб. см). Температуру проби води доводять до 48 град. С на водяній бані, після чого додають 10 куб. см культури Е. coli (п. 12.1.1). Суміш проби води і бактеріальної культури залишають на 3 хвилини при 48 град. С, після чого її акуратно переливають у флакон з 2%-го МПА, обережно перемішують, щоб уникнути утворення пухирців повітря. Потім суміш розливають швидко, але обережно, у рівних об'ємах (по 20 куб. см) по 10 порожніх чашках Петрі. Чашки залишають до застигання з частково відкритими кришками. Закриті чашки інкубують у положенні догори дном (не складають більше, ніж 6 чашок) при (36 +- 1) град. С протягом (4 +- 2) годин, після чого виймають з термостату і залишають у темному місці при кімнатній температурі на (18 +- 2) години. Постановка контролів здійснюється за п.п. 12.1.4. та 12.1.5.
12.2.2. Облік результатів
Облік результатів проводять наступним шляхом: при наявності зон лізісу підраховують їх кількість на 10-ти чашках і множать на 10, що у підсумку дає вміст коліфагів в 1000 куб. см проби.
12.3. Визначення коліфагів прямим методом (II-ий варіант)
Принцип прямого визначення коліфагів полягає в дослідженні певного об'єму (20 куб. см) від усієї проби води шляхом його прямого посіву двошаровим агаровим методом і наступного підрахунку зон лізісу на газоні Е. coli.
Складові методу вказані у п. 12.2.
12.3.1. Проведення аналізу
Попередньо розливають у 4 стерильні чашки Петрі по 15-20 куб. см 2%-го МПА (п. 5.2.4.2) (витримують до повного застигання агару) та у 4 стерильні пробірки по 5 куб. см 1,0%-го МПА, охолодженого до температури (45 +- 5) град. С. В пробірки з 1,0%-ним МПА додають по 5 куб. см проби води, попередньо нагрітої до кімнатної температури, та по 1 куб. см Е. coli (п. 12.1.1). Обережно перемішують вміст пробірок, запобігаючи утворенню бульбашок повітря, і виливають на поверхню 2%-го МПА. Агар рівномірно розподіляють і залишають до застигання на горизонтальній прохолодній поверхні. Підсушують чашки шляхом інкубування з частково відкритими кришками, після чого їх закривають і інкубують у положенні вверх дном (не складати більше ніж 6 чашок) при (36 +- 1) град. С протягом (6 +- 2) годин, після чого чашки з посівами виймають з термостату і залишають у темному місці при кімнатній температурі на (18 +- 2) години. Цей прийом запобігає негативному впливу на облік результатів супутньої мікрофлори. Постановка контролів здійснюється за п.п. 12.1.4. та 12.1.5.
12.3.2. Облік результатів
При наявності зон лізісу підраховують їх кількість на 4-х чашках і множать на 50, що у підсумку дає вміст коліфагів в 1 куб. дм проби.
При відсутності коліфагів у пробі при прямому посіві застосовують титраційний метод в разі необхідності.
Вимоги безпеки
Мікробіологічні дослідження проводять з дотриманням вимог безпеки відповідно до ДСП 9.9.5.-080-2002 "Правила влаштування і безпеки роботи в лабораторіях (відділах, відділеннях) мікробіологічного профілю", затв. Постановою Головного державного санітарного лікаря України від 28 січня 2002 р. N 1.
При проведенні досліджень на збудники особливо небезпечних інфекцій дослідження проводять з дотриманням вимог безпеки відповідно до ДСП N 9.9.5.035-99 "Безпека роботи з мікроорганізмами I-II груп небезпеки", затв. Постановою Головного державного санітарного лікаря України від 01.07.99 за N 35.
Додаток 1
Таблиця 1
Визначення індексу бактерій групи кишкових
паличок при дослідженні куб. 333 см води *
------------------------------------------------------------------ |
----------------------
* При дослідженні інших об'ємів води відповідно зменшують або збільшують індекс. Наприклад, при дослідженні об'ємів 10, 1 та 0,1 індекс зменшують у 10 разів; при дослідженні об'ємів 0,1; 0,01 та 0,001 індекс збільшують у 10 разів; при дослідженні об'ємів 0,01; 0,001 та 0,0001 індекс збільшують у 100 разів і т.д.
Якщо при дослідженні води було посіяно більше 3-х десятикратних об'ємів води або розбавлень, то враховують 3 такі послідовні об'єми, в останньому з яких отримано один або декілька негативних результатів. Наприклад: 10 куб. см - три пробірки позитивні, 1 куб. см - те ж саме, 0,1 куб. см - те ж саме, 0,01 куб. см - те ж саме, 0,001 куб. см - позитивний результат тільки в одній пробірці. Враховують об'єми 0,1; 0,01 та 0,001 куб. см.
** наведені в таблиці варіанти є вірогідними. В інших випадках кількісний облік неможливий, результат оцінюється якісно, дослідження необхідно повторити.
Таблиця 2
НВЧ і 95% вірогідні границі коліфагів
для різних комбінацій позитивних і негативних
результатів при використанні однократно об'ємів води:
500, 200, 100, 50 і 20 куб. см
-------------------------------------------------------------------- |
Таблиця 3
Первинна ідентифікація ентеробактерій
за біохімічними реакціями в комбінованому середовищі
------------------------------------------------------------------ |
Умовні позначення:
К - кислота,
КГ - кислота та газ,
Г - газ,
- облік реакції важкоздійсненний,
- реакція негативна,
+ реакція позитивна.
-------------------------
* - не включено відомостей по роду Erwinia, оскільки при звичайному (37 град. С) культивуванні посівів ці ентеробактерії, як правило, не ростуть або дають повільний скупий ріст.
Додаток 2
(рекомендований)
Ведення
еталонних культур
Ведення еталонних культур забезпечує максимальне збереження типових властивостей штамів, що досягається дотриманням принципів їх культивування, контролю та збереження.
Збереження культур здійснюється відповідно до п. 2.7. "Положения о порядке учета, хранения, обращения, отпуска и пересылки культур бактерий, вирусов, риккетсий, грибов, простейших, микоплазм, бактерийных токсинов, ядов биологического происхождения".
Лабораторія повинна мати дозвіл на роботу з мікроорганізмами відповідних груп патогенності, оформлений згідно з ДСП N 9.9.5.064.2000.
1. Ведення бактеріальних культур аеробів
і факультативних анаеробів
Основні положення
Як контрольні тест-штами використовуються еталонні культури, отримані з офіційно визнаних колекцій мікроорганізмів (п. 4.5).
Зберігання запасів робочої культури здійснюється у стовпчику напіврідкого агару, термін зберігання 3 міс.
Для цільового використання придатна добова ("нічна") культура еталонного штаму, яка пройшла не більше 2 пасажів на поживних середовищах з моменту висівання з середовища для збереження запасів робочої культури.
Поповнення запасів робочої культури допускається не більше трьох разів. У зв'язку з цим термін використання еталонної культури з моменту розкриття ампули - 1 рік.
На етапах відновлення з ліофілізованого стану та поповнення запасів робочих культур здійснюється контроль збереження видових і паспортних властивостей тест-культури.
Культура зі зміненими властивостями в аналізі не використовується. До закінчення року необхідно отримати нову ліофілізовану еталонну культуру з колекції мікроорганізмів.
Процедура ведення культури включає такі етапи:
- відновлення ліофілізованої культури;
- створення та зберігання запасів робочої культури;
- відновлення запасів робочої культури;
- підготовка культури для цільового використання в аналізі;
- контроль видових і паспортних властивостей.
1.1. Відновлення ліофілізованої еталонної культури.
Відтягнутий кінець ампули з ліофілізованою культурою нагрівають над полум'ям пальника. Вологим кінцем стерильного ватного тампону доторкуються до нагрітої частини, у результаті чого з'являються тріщини. Кінець ампули накривають змоченою 70-процентним етиловим спиртом і добре віджатою тришаровою марлевою серветкою та відламують пінцетом.
Після відкриття ампула залишається накритою тією ж самою серветкою протягом 1-2 хвилин. Потім серветку обережно знімають і разом із залишками скла занурюють у дезрозчин. В ампулу додають приблизно 0,5 куб. см поживного бульйону (п. 5.2.1) для регідратації. Вміст ампули перемішують, переносять стерильною пастерівською піпеткою чи шприцем у пробірку з поживним бульйоном та інкубують при (36 +- 1) град. С протягом 18-24 год.
Після інкубації з поживного бульйону роблять висів петлею на скошений поживний агар у дві пробірки (п. 5. 4.2).
Посіви інкубують при (36 +- 1) град. С протягом 18-24 год.
Одну пробірку з посівом використовують для постановки тестів на відповідність отриманого штаму видовим паспортним властивостям (п.п. 1.5.2.-1.5.5 Додатку 2).
Другий посів на скошеному поживному агарі використовують для створення запасів робочої культури (п. 1.2 Додатку 2).
Бульйонну культуру Е. coli М17-02, що залишилася, використовують для оцінки ступеня дисоціації еталонного штаму, як це описано в п. 1.5.1 Додатку 2.
У разі невідповідності штаму видовим і паспортним властивостям і (чи) при наявності понад 25% поліморфних (нетипових) колоній у R-формі отриману культуру для роботи не використовують.
1.2. Створення запасів робочої культури
При задовільному проходженні контрольних тестів (п.п. 1.5.1-1.5.5 Додатку 2) культуру зі скошеного поживного агару засівають уколом у стовпчик з напіврідким агаром (п. 5.2.4.2). В залежності від інтенсивності роботи лабораторії посів проводять у 4-10 пробірок із розрахунку по 1-3 пробірки на 1 місяць роботи та 1 пробірку для поповнення запасів робочої культури через 3 міс. на наступний квартал (п. 1.3 Додатку 2).
Посіви інкубують 18-24 год. при (36 +- 1) град. С. При наявності росту пробірки закривають гумовими (силіконовими) пробками та закладають на зберігання при температурі (6 +- 2) град. С.
Одну з пробірок з культурою, що призначена для поповнення робочих запасів, маркують і зберігають окремо. Запаси робочої культури бажано зберігати в окремому холодильнику.
1.3. Поповнення запасів робочої культури
Поповнення запасів робочої культури проводиться в кінці третього, шостого та дев'ятого місяця з моменту розкриття ампули (кожні 3 міс.).
Для поповнення запасів робочої культури використовується субкультура на середовищі збереження, що була отримана раніше при створенні запасів або при черговому їх поповненні.
Із пробірки з культурою, що призначена для поповнення запасів, проводиться посів у поживний бульйон п. 5.2.2. Посіви інкубують при (36 +- 1) град. С 18-24 год.
Після інкубації з поживного бульйону роблять висів петлею у дві пробірки зі скошеним поживним агаром (п. 5.2.4.2). Посіви інкубують при (36 +- 1) град. С (18 +- 2) год.
Один з посівів використовують для постановки тестів на відповідність отриманого штаму видовим, паспортним властивостям (п. 1.5.2-1.5.5 Додатку 2).
Другий посів на скошеному поживному агарі використовують для поповнення запасів робочої культури (п. 1.2 Додатку 2).
Бульйонну культуру Е.coli М17-02, що залишилася, використовують для оцінки ступеню дисоціації еталонного штаму, як це описано в п. 1.5.1 Додатку 2.
При наявності понад 25% поліморфних (нетипових) колоній та (або) при невідповідності штама видовим і паспортним властивостям отриману культуру для подальшої роботи не використовують.
Необхідно отримати нову ампулу з еталонною культурою і розпочати процедуру ведення тестового штаму спочатку.
При задовільному проходженні контрольних тестів процедура закладки культури на зберігання здійснюється відповідно п. 1.2 Додатку 2.
Відновлення запасів робочої культури проводять тільки три рази.
До закінчення року використання необхідно отримати нову еталонну культуру з колекції мікроорганізмів.
1.4. Підготовка культури для цільового використання в аналізі
Напередодні використання культуру з напіврідкого агару висівають у 2 пробірки зі скошеним поживним агаром (п. 5.2.4.2). Посів інкубують 18-24 год. при (36 +- 1) град. С.
Культуру з однієї пробірки використовують за призначенням. Друга пробірка з культурою на скошеному поживному агарі використовується для отримання культури для роботи на наступний (другий) день.
При необхідності отримання культури тест-штаму на третій день висів знову проводять з напіврідкого агару.
1.5. Контроль еталонних бактеріальних культур
Постановка контролю включає:
- оцінку ступеня дисоціації культури Е. coli М17-02;
- перевірку видових властивостей бактеріальних культур;
- перевірку здатності Е. coli С або Е. coli В на однорідність і відсутність забруднення фагом.
1.5.1. Оцінка ступеня дисоціації культури Е. coli М17-02
З 18-годинної бульйонної культури роблять 10-кратні розбавлення фізіологічним розчином. По 0,1 куб. см 5- і 6-кратного розбавлення засівають на 2 чашки поживного агару, попередньо підсушених у термостаті. Шпателем посіви розподіляють по поверхні агару до повного зникнення вологи та інкубують в термостаті при температурі (37 +- 1) град. С протягом 18-24 год. Відбирають чашки, на яких виросло від 30 до 100 колоній. Перевірку тест-штамів на дисоціацію проводять шляхом візуального перегляду ізольованих колоній на чашках у прямому і косо направленому світлі крізь бінокулярну лупу або мікроскоп при малому збільшенні.
На поживному агарі бактерії виду Е. coli утворюють колонії середнього розміру 3-5 мм, плоско-випуклі, круглі, гладкі з рівним краєм (S-форма), вологі, блискучі, прозорі у прямому і непрозорі (опалово-мутні) у косонаправленому світлі. У косонаправленому світлі колонії ешеріхій можуть мати рівномірну зернистість.
У R-формі колонії ешеріхій більш пласкі, більшого розміру, неправильної форми з нерівними краями і шорсткуватою матовою поверхнею.
При наявності дисоціації (за розміром, S-R-дисоціація, тощо) підраховують кількість змінених колоній і загальну кількість колоній, які було проглянуто.
Загальна кількість бактерій, які продивилися, не повинна бути меншою 30. Потім розраховують відсоток дисоціації за формулою:
кількість змінених колоній |
Якщо відсоток дисоційованих колоній більше 25%, то дана культура не придатна для подальшого використання.
1.5.2. Контроль видових властивостей Е. coli С або Е. coli В та Е. coli М17-02
Після відновлення ліофілізованої культури проводиться типування культури за біохімічними властивостями до виду.
Ідентифікацію рекомендується проводити з використанням тест-систем для біохімічної ідентифікації родини Enterobacteriaceae, дозволених до застосування. Правомірною є постановка окремих біохімічних тестів.
Перед черговим щоквартальним створенням запасу робочої культури оцінку еталонного штаму Е. coli проводять шляхом підтвердження наступних головних властивостей:
- відсутності оксидазної активності;
- негативності забарвлення за Грамом;
- здатності утворювати на середовищі Ендо характерні темно-червоні (малинові) колонії з металевим блиском і відбитком на середовищі;
- здатності утилізувати лактозу до кислоти і газу при температурі 37 град. С протягом 24-48 год. і 44 град. С протягом 24 год.;
- здатності утилізувати глюкозу до кислоти і газу при температурі 37 град. С протягом 24 год.
Якщо культура не відповідає видовим властивостям, то вона непридатна для подальшого використання.
1.5.3. Контроль чутливості Е. coli С або Е. coli В (позитивний контроль)
Чутливість тест-культури Е. coli С або Е. coli В до ураження та лізування специфічним фагом є головною властивістю тест-культури, на якій базується метод визначення фагів у воді.
Перевірка чутливості здійснюється кожного разу, коли із запасів зберігання береться нова пробірка з робочою культурою, яка зберігається на агаровому косяку або стовпчику.
Бактеріальну суспензію готують за п. 12.1.1.
З фагової культури високого титру (еталонний контроль фагу Т2) готують 10-кратні розбавлення і виконують посів на чашку по 1 куб. см розбавлень, в яких концентрація бактеріофагу складає
3 2 3 приблизно 10 - 10 БУО/см . Процедуру посіву проводять відповідно до п. 12.3.1. (двошаровий агаровий метод), але кінцевий облік результатів можна робити після 4-6 годин інкубації.
Культура вважається чутливою та придатною для проведення аналізу при наявності чітких зон лізису на повноцінному бактеріальному газоні. При відсутності зон лізису культура Е. coli С або Е. coli В не може бути використана в аналізі і підлягає заміні.
1.5.4. Контроль культури Е. coli С або Е. coli В на забруднення фагом
Бактеріальну суспензію готують за п. 12.1.1, вносять по 0,5 куб. см у пробірки з 5 куб. см розтопленого і охолодженого до 45 град. С 1,0%-го МПА, добре перемішують і виливають у чашку Петрі на поверхню застиглого 2%-го МПА. Посів інкубують при (36 +- 1) град. С протягом (4 +- 2) год.
Перегляд результатів виконують у прохідному світлі. Бактеріальна культура повинна давати рівномірний газон росту. Наявність зон лізису в контролі свідчить про забрудненість культури Е. coli С або Е. coli В фагами.
1.5.5. Контроль видових властивостей Pseudomonas aeruginosa і Pseudomonas fluorescens
Оцінку еталонного штаму Pseudomonas aeruginosa і Pseudomonas fluorescens проводять шляхом підтвердження наступних властивостей:
- наявності оксидазної активності;
- негативності забарвлення за Грамом;
- росту на МПБ у вигляді сріблястої плівки на поверхні з утворенням кільця синьо-зеленого пігменту;
- наявності синьо-зеленого пігменту при рості на МПА при (36 +- 1) град. С; здатності росту на поживному агарі при (42 +- 1) град. С протягом 24 год. (для Pseudomonas aeruginosa);
- здатності росту на поживному агарі при 4 град. С протягом 24 год. (для Pseudomonas fluorescens).
Якщо культура не відповідає видовим властивостям, то вона непридатна для подальшого використання.
2. Культивування, зберігання і контроль
еталонних культур бактеріофагів
Як еталонний штам для проведення контролю культури хазяїна при проведенні дослідження на коліфаги використовується фаг Т2, який містить ДНК.
Процес культивування еталонного штаму коліфагу Т2 складається з 2 функціональних блоків:
- відновлення ліофілізованної культури;
- створення запасів еталонної культури і культур для цільового використання;
- визначення титру фагу.
2.1. Відновлення ліофілізованої культури
Відтягнутий кінець ампули з ліофілізованою культурою нагрівають над полум'ям пальника. Вологим кінцем стерильного ватного тампона доторкуються до нагрітої частини, у результаті чого з'являються тріщини. Кінець ампули накривають змоченою 70-процентним етиловим спиртом і добре віджатою тришаровою марлевою серветкою та відламують пінцетом.
Після відкриття ампула залишається накритою тією ж серветкою протягом 1-2 хвилин. Потім серветку обережно знімають і разом із залишками скла занурюють у дезрозчин. В ампулу вносять 0,5 куб. см поживного бульйону (п. 5.2.1) для регідратації.
2.2. Створення запасів еталонної культури і культур для цільового використання
Використовують звичайні процедури для розмноження фагів, які описані у доступній літературі. Нижче подається один з методів (за Апельманом), котрий дозволяє отримувати задовільні результати.
Необхідну кількість пробірок, яка відповідає титру наявного в
6 7 лабораторії еталонного фагу Т2 (10 - 6 пробірок, 10 - 7 пробірок і т.д.), з 4,5 куб. см МПБ ставлять у штатив у 2-х повторностях. В першу пробірку вносять 0,5 куб. см наявного в лабораторії коліфага Т2. Вміст пробірки перемішують і 0,5 куб. см рідини з першої пробірки переносять у другу пробірку. Процедуру повторюють для інших пробірок до отримання кінцевого розведення. В усі пробірки вносять по 0,2 куб. см 4-годинної культури Е. coli С або Е. coli В.
Окремо проводять:
- контроль культури коліфага Т2: 5 куб. см МПБ та 0,2 куб. см бульйонної культури коліфага Т2;
- контроль культури Е. coli С або Е. coli В: 5 куб. см МПБ та 0,2 куб. см бульйонної культури Е.coli С або Е. coli В;
- контроль стерильності МПБ: 5 куб. см МПБ без додавання Е. coli С або Е. coli В та коліфага Т2.
Посіви інкубують при (36 +- 1) град. С протягом 4-6 годин. Облік результатів виконують одразу після виймання пробірок з термостату. Титром фагу вважають те максимальне розведення, при якому спостерігається повний лізіс культури Е. coli С або Е. coli В. Практично це відповідає тій останній пробірці у ряду, в якій бульйон візуально виглядає прозорим.
Для отримання чистої культури еталонного коліфагу Т2 відбирають пробірки з прозорим МПБ і фільтрують через мембранний фільтр з розміром пор 0,2 мкм, який затримує бактерії, але пропускає фаги. Для тривалого зберігання отриманий фільтрат розподіляють по 2 куб. см у малі пробірки або флакончики і зберігають у морозильній камері при -20 град. С.
При відсутності можливості фільтрування через мембранний фільтр після інкубації вміст пробірок переливають в одну ємкість і додають хлороформ у співвідношенні 1:10, герметично закривають, інтенсивно струшують і залишають на ніч у холодильнику. Після цього відбирають бульйон над хлороформом і переносять у стерильні пробірки або флакони, герметично закривають і зберігають у холодильнику при мінус (20 +- 2) град. С.
В разі необхідності для перевірки титру фагу проводять прямий посів десятикратних розбавлень коліфагу Т2 двошаровим агаровим методом (п. 12.3.1) з використанням культури Е. coli С або Е. coli В. 6
Титр фагової суспензії має бути вище 10/куб. см. З часом титр фагової вихідної суспензії може зменшуватися, особливо при повторному заморожуванні-розморожуванні. У цьому випадку може бути необхідним повторення циклу для отримання достатньо високого титру.
Після виконання робіт з культурами фагів для попередження внутрішньолабораторної контамінації проводять ретельну обробку робочих поверхонь деззасобами і УФО.
Додаток 3
Нормативні посилання
1. ДСанПіН 383/1940 Вода питна. Гігієнічні вимоги до якості води централізо-ваного господарсько-питного водопостачання//Збірник важливих офіційних документів з санітарних і протиепідемічних питань. - К., 1999. - Т.5, Ч.3.
2. ГОСТ 18963-73 "Вода питьевая. Методы санитрно-бактериологического анализа" - М., 1973.
3. Методические указания по санитарно-микробиологическому анализу воды поверхностных водоемов: N 2285-81. - М., 1981.
4. Руководство по контролю качества питьевой воды. - Женева: ВОЗ, 1994. Ч. 1.
5. ИСО 9308-1: 1990. Качество воды. Обнаружение и подсчет колиформных организмов, термотолерантных колиформных организмов и предполагаемых Е.coli. - Ч. 1: Метод мембранной фильтрации.
6. ИСО 9308-2: 1990. Качество воды. Обнаружение и подсчет колиформных организмов, термотолерантных колиформных организмов и предполагаемых Е.coli. - Ч. 2: Титрационный метод (определение наиболее вероятного числа).
7. ИСО 6222-2: 1986. Качество воды. Проведение анализа на наличие жизнеспособных микроорганизмов.
8. Санитарно-микробиологический анализ питьевой воды. Методические указания: МУК 4.2.10.18-01. - Москва, 2001.
9. Методические указания по обнаружению возбудителей кишечных инфекций бактериальной природы в воде. - М., 1980.
10. Інструкція по організації та проведенню протихолерних заходів, клініці та лабораторній діагностиці холери: Наказ МОЗ України від 30.05.97 р. N 167.
11. Методические рекомендации по контролю и оценке вирусного загрязнения объектов окружающей среды: N 4146-86. - М., 1986.
12. Методические рекомендации по организации и проведению эпидемиологического и санитарно-вирусологического надзора за качеством воды водоисточников питьевой воды в системе водоснабжения с целью профилактики заболеваемости гепатитом А и другими кишечными вирусными инфекциями. - М., 1990.
13. ДСП N 9.9.5-064-2000 Порядок видачі дозволів на роботу з мікроорганізмами I-IV груп патогенності та рекомбінантними молекулами ДНК. - Затв. Постановою Головного державного санітарного лікаря України від 27.12.2000 за N 64.
14. ДСП N 9.9.5.-080-2002 Правила влаштування і безпеки роботи в лаборато-ріях (відділах, відділеннях) мікробіологічного профілю. - Затв. Постановою Головного державного санітарного лікаря України від 28.01.02. за N 1.
15. ISO 10705-2 Water quality. Detection and enumeration of bacteriophages. - Р. 2: Enumeration of somatic coliphages.
16. ISO 5667-2:1991 Water quality. Sampling. - Р.2: Guidance on sampling techniques.
17. ISO 5667-3:1994 Water quality. Sampling. - Р.3: Guidance on the preservation and handling of samples.
18. ISO 5667-5:1991 Water quality. Sampling. - Р.5: Guidance on sampling of drinking water and water used for food and beverage processing.