МІНІСТЕРСТВО ОХОРОНИ ЗДОРОВ'Я УКРАЇНИ

НАКАЗ
24.05.2013 N 425

Про затвердження Методичних рекомендацій
"Методи виділення та ідентифікації сальмонел"

Відповідно до статті 6 Закону України "Про захист населення від інфекційних хвороб" та Положення про Міністерство охорони здоров'я України, затвердженого Указом Президента України від 13 квітня 2011 року N 467, з метою поліпшення якості лабораторної діагностики сальмонельозів НАКАЗУЮ:

1. Затвердити Методичні рекомендації "Методи виділення та ідентифікації сальмонел" (далі - Методичні рекомендації), що додаються.

2. Міністру охорони здоров'я Автономної Республіки Крим, керівникам структурних підрозділів з питань охорони здоров'я обласних, Київської та Севастопольської міських державних адміністрацій, закладів охорони здоров'я, медико-санітарних частин, науково-дослідних інститутів, що належать до сфери управління Міністерства охорони здоров'я України, ректорам вищих медичних (фармацевтичного) навчальних закладів, забезпечити використання Методичних рекомендацій при здійсненні лабораторної діагностики сальмонельозів.

3. Державній санітарно-епідеміологічній службі України (А. Пономаренко) прийняти цей наказ до керівництва та застосування під час здійснення державного санітарно-епідеміологічного нагляду.

4. Департаменту реформ та розвитку медичної допомоги (М. Хобзей), відповідно до покладених завдань та функцій, у межах компетенції, здійснювати контроль за дотриманням Методичних рекомендацій при наданні лікувально-профілактичної допомоги.

5. Контроль за виконанням цього наказу покласти на першого заступника Міністра О. Качура.

Міністр Р. Богатирьова

Затверджено
Наказ Міністерства охорони
здоров'я України 24.05.2013 N 425

Методичні рекомендації
"Методи виділення та ідентифікації сальмонел"

1. Загальні вимоги

1.1. У цих методичних рекомендаціях визначені основні підходи до проведення лабораторних досліджень з метою виявлення та ідентифікації сальмонел в клінічному матеріалі, харчових продуктах і об'єктах середовища життєдіяльності людини.

1.2. Організація і проведення лабораторних досліджень з метою діагностики та профілактики сальмонельозів - важлива складова системи епідеміологічного нагляду. Цей розділ роботи включає кадрове забезпечення, зміцнення матеріальної бази лабораторій, забезпечення їх достатньою кількістю поживних середовищ і діагностичних препаратів гарантованої якості, створення умов для дотримання вимог біобезпеки.

1.3. Дослідження проводяться у відповідності з діючою в лабораторії системою забезпечення якості, яка передбачає контроль поживних середовищ, діагностичних тестів, засобів вимірювальної техніки, обладнання, дотримання параметрів інкубації, стерилізації і знешкодження.

1.4. Дослідження на сальмонели проводять з метою діагностики захворювань, контролю ефективності лікування (контроль перед випискою), виявлення бактеріоносіїв серед перехворілих, контактних із хворими та декретованих груп населення, розслідування спалахів з метою визначення джерел та факторів передачі збудників інфекції, а також з метою визначення відповідності гігієнічним вимогам безпеки харчових продуктів, виявлення обсіменіння об'єктів середовища життєдіяльності людини.

1.5. Комплекс методів діагностики сальмонельозної інфекції, лабораторного контролю харчових продуктів, продовольчої сировини і об'єктів зовнішнього середовища включає:

класичний бактеріологічний (посів досліджуваного матеріалу на відповідні поживні середовища, виділення культур сальмонел і їх ідентифікація);

прискорені та експрес-методи діагностики: імунофлуоресцентний, латексної аглютинації, імуноферментного аналізу (ІФА), імунохроматогріфічний (ІХА);

автоматизовані та напівавтоматизовані системи;

молекулярно-генетичні;

серологічні - РПГА з еритроцитарним діагностикумом і цистеїнова проба, що виявляють специфічні антитіла різної фізико-хімічної природи;

1.6. Кінцевий діагноз сальмонельозу людині може бути поставлений: при спорадичних захворюваннях - тільки при лабораторному його підтвердженні в кожному випадку; на спалахах з встановленою сальмонельозною етіологією у одночасно захворілих - на підставі клінічної картини та епідеміологічних даних.

1.7. Складнощі виділення сальмонел пов'язані з присутністю у складі мікрофлори кишечнику 10¹¹ конкурентних мікроорганізмів 300 - 400 видів, непостійним виділенням їх з випорожненнями, травмуванням та загибеллю клітин при транспортуванні. Для подолання цього при виділенні сальмонел обов'язково використовуються методи концентрування, накопичення.

1.8. З метою отримання об'єктивної інформації про циркуляцію сальмонел на території країни, своєчасного відстеження появи нових або зміни домінуючих збудників, необхідно збирати і надсилати до ДЗ "Центральна санітарно-епідеміологічна станція Міністерства охорони здоров'я України" на ідентифікацію, підтвердження та подальше вивчення наступні штами сальмонел:

вперше виділені та такі, що рідко зустрічаються на території регіону; S.Java, S.Paratyphi B, S.Typhi;

у яких утруднене серологічне типування;

стійкі до дезінфекційних засобів та/або мають множинну стійкість до антибіотиків;

виділені під час спалахів;

виділені з матеріалу від померлих;

мають відхилення від типових властивостей.

2. Загальна характеристика бактерій роду Salmonella

Бактерії роду Salmonella - лактозонегативні, грамнегативні палички. Спор і капсул не утворюють, добре фарбуються аніліновими барвниками. Рухливі, мають перитрихіальні джгутики, за виключенням S.Gallinarum.

Сальмонели є факультативними анаеробами. Вони добре ростуть на звичайних поживних середовищах та середовищах, що містять жовч. На щільних середовищах можуть утворювати колонії в S та R - формах. На рідких середовищах - S-форми сальмонел ростуть дифузно, R - форми створюють осад, культуральна рідина залишається практично прозорою. Колонії в S-формі середніх розмірів, за винятком окремих серологічних варіантів (S.Paratyphi A, S.Abortusequi, S.Abortusovis, S.Typhisuis та деякі інші), які утворюють більш дрібні колонії діаметром біля 1 мм. На середовищах, що містять лактозу, утворюють безбарвні колонії, на вісмут-сульфітному агарі - колонії чорного або сірого кольору з чорним ореолом, металевим блиском та чорною основою під колонією. Оптимальна температура росту - 35 - 37 °C, pH середовища - 7,2 - 7,4. При більш низькій температурі (20 °C) або більш високій (42 °C) та при іншій реакції середовища (pH від 5,0 до 8,0) вони також можуть розмножуватись, але значно повільніше, ніж при оптимальних умовах. При температурі нижче 5 °C ріст їх повністю припиняється.

Сальмонели біохімічно активні мікроорганізми. Ферментативні властивості різноманітні, не тільки у окремих представників окремих підродів, але можуть відрізнятися в межах одного і того ж серовару. Сальмонели оксидазонегативні, каталазопозитивні, не розщеплюють сечовину, зазвичай утворюють сірководень (S.Paratyphi A, та деякі інші серовари, рідко) і не утворюють індол, хоча іноді зустрічаються окремі серовари або їх різновиди, які утворюють індол. Не ферментують лактозу, саліцин, утилізують цитрат на середовищі Сімонса (S.Typhi не утилізують) і варіабельні на ацетатному агарі.

Для сальмонел характерні ферменти лізин-, орнітиндекарбоксилаза і аргініндегідролаза, хоча відомі штами S.Typhimurium, S.Enteritidis v. ratin та деяких інших сероварів, які мають знижений вміст ферменту лізиндекарбоксилази або зовсім його не мають. Всі сальмонели дають позитивну реакцію з метиловим червоним (далі - MR) і негативну реакцію Фогеса-Проскауера (далі - VP), редукують нітрати, ферментують маніт. Зазвичай ферментують глюкозу з утворенням кислоти та газу, але серед таких сероварів як S.Typhimurium, S.Derby, S.Thompson, S.Enteritidis, S. Paratyphi B, зустрічаються "безгазові" варіанти. Постійно не утворюють газ S.Typhi і S.Gallinarum. Не ферментують сахарозу і адоніт, хоча відомі випадки виділення штамів окремих сероварів, що ферментують сахарозу (S.Newport, S.Meleagridis, S.Stenleyville та ін.). Майже всі сальмонели швидко ферментують сорбіт. Як правило, не розріджують желатину.

Відношення сальмонел до арабінози, дульциту, інозиту, ксилози, рамнози, трегалози, гліцерину за Штерном, а також до d-, і- та L-тартрату, цитрату і мукату неоднакове навіть у межах одного серологічного типу, що дозволяє підрозділяти їх на ряд стабільних біохімічних варіантів.

Сальмонели відносно стійкі в зовнішньому середовищі: витримують pH в діапазоні 4 - 9; у воді відкритих водоймищ та питній зберігаються від 11 до 120 днів; в морській воді - від 15 до 27 днів; в ґрунті - від 1 до 9 міс.; в кімнатному пилу - від 80 днів до 18 міс.; у м'ясі і ковбасних виробах - від 60 до 130 днів (у замороженому м'ясі - від 6 до 13 міс.); у молоці при кімнатній температурі - до 10 днів; в холодильнику - до 20 днів; у вершковому маслі - 52 - 128 днів; у яйцях - до 13 міс.; в сирах - до 1 року; на яєчній шкаралупі - від 17 до 24 днів; в яєчному порошку від 3 до 9 місяців; на овочах і фруктах 5 - 10 днів; на заморожених овочах та фруктах - від 2 тижнів до 2,5 місяців. При нагріванні до 56 °C сальмонели гинуть протягом 45 - 60 хв., при 70 °C - протягом 5 - 10 хв., в товщі шматка м'яса (10 см) витримують кип'ятіння протягом тривалого часу.

Соління та копчення чинить на них незначний вплив. Високі концентрації солей та цукру обмежують або пригнічують ріст сальмонел. Пряме сонячне опромінення діє на них згубно.

Розчини дезінфікуючих засобів (5 % фенол, 3 % хлорамін, 3 % лізол) вбивають сальмонели протягом 2 - 3 хвилин.

Госпітальні штами сальмонел відрізняються множинною стійкістю до антибіотиків і фізико-хімічних чинників середовища (включаючи дезінфектанти).

Резервуари і джерела збудника: багато видів тварин і птахів, зокрема сільськогосподарських, диких і навіть домашніх, у яких серовари сальмонел, небезпечні для людини, викликають як захворювання, так і носійство. Описані випадки зараження сальмонелами від домашніх черепашок і котів. У тварин реалізується фекально-оральний механізм передачі, у птахів можлива також трансоваріальна передача сальмонел. Людина може бути джерелом деяких сероварів сальмонел.

Тварини можуть виділяти збудника місяцями, хвора людина - від 3 днів до 3 тижнів. Близько 1 % інфікованих дорослих і 5 % дітей старше 5 років здатні виділяти сальмонели більше року.

Механізм передачі збудника - фекально-оральний; шлях передачі переважно харчовий; фактори передачі - продукти тваринного походження (м'ясні, молочні, яйця); менше епідеміологічне значення мають риба, рибні продукти, продукти рослинного походження (овочі, фрукти, ягоди), а також дріжджі, кондитерські барвники і навіть наркотичні засоби (марихуана). Вода, переважно, бере опосередковану участь в передачі сальмонел.

Найбільшу небезпеку, як можливі фактори передачі сальмонел, являють продукти та страви, які після приготування не піддають термічній обробці та/або зберігають тривалий час, в тому числі і при кімнатній температурі. При цьому навіть при інтенсивному розмноженні сальмонел в харчових продуктах їх органолептичні властивості (смак, запах) і зовнішній вигляд не змінюється.

Харчові продукти, інфіковані навіть незначними дозами сальмонел (кілька десятків клітин), можуть виявитися факторами передачі.

Не виключається можливість реалізації повітряно-пилового, а також побутового шляху передачі. Природна сприйнятливість людей висока, особливо виражена у дітей перших місяців життя та у людей похилого віку, і підвищується при імунодефіцитах, включаючи СНІД.

Слід відмітити, що останні 20 років набула глобального розповсюдження S.Enteritidis. Представники цього серовару викликають спалахи сальмонельозу при низькій дозі контамінації продукту, а захворювання характеризуються зазвичай більш маніфестними клінічними проявами.

3. Сучасна таксономія бактерій роду Salmonella

Рід Salmonella входить до родини Enterobacteriaceae і складається з мікроорганізмів, споріднених за фенотиповими і генотиповими властивостями. Ферментативні ознаки сальмонел, покладені в основу їх поділу на підвиди, представлені в таблиці 1.

За сучасною класифікацією рід Salmonella представлений двома видами - S.enterica і S.bongori.

Вид S.enterica ділиться на 6 підвидів (subsp.), які позначаються наступними символами:

I - або назва серовару для сероварів виду S.enterica subsp. enterica;

Для інших підвидів виду S.enterica введені наступні позначення:

II - для сероварів виду S.enterica subsp.salamae;

IIIa - для сероварів виду S.enterica subsp.arizonae;

IIIb - для сероварів виду S.enterica subsp.diarizonae;

IV - для сероварів виду S.enterica subsp.houtenae;

VI - для сероварів виду S.enterica subsp.indica;

V - Вид S.bongori - для серовара S.bongori subsp. bongori. Всі серовари виду S.bongori мають символ V.

Розподіл на підвиди має певне епідеміологічне значення, оскільки основним, природним резервуаром сальмонел підвиду I є теплокровні тварини, а для представників решти підвидів (II, IIIa, IIIb, IV, VI) і виду S.bongori - холоднокровні тварини і навколишнє середовище. Диференціальна характеристика видів і підвидів Salmonella надана в таблиці 1.

Таблиця 1. Диференціальна характеристика
видів і підвидів Salmonella

__________

(*) - S.Typhimurium d, S.Dublin -;

Позначення реакцій:

"+" - 90 % або більше позитивних реакцій;

"-" - 90 % або більш негативних реакцій;

d - різні серовари дають різні реакції

Сальмонели кожного підвиду розділяються на серологічні варіанти за O- і H-антигенною характеристикою. Доповнені схеми Кауфмана-Уайта, що випускаються періодично Референс-центром ВООЗ по сальмонелам (Інститут Пастера, Париж) ґрунтуються саме на цих принципах номенклатури сальмонел. Так, 8 видання схеми Кауфмана-Уайта, опубліковане в 2001 році, включає 67 серологічних груп і перелік антигенної структури 2501 серовара сальмонел, відомих на даний час (додається).

Підвид I (S.enterica subsp. enterica) є найчисленнішим і включає абсолютну більшість відомих сероварів сальмонел. Кількість сероварів кожного підвиду дана в таблиці 2.

Таблиця 2. Число сероварів, що входять до видів і підвидів сальмонел

Число відомих серологічних варіантів сальмонел постійно зростає. Разом з тим світовий досвід указує, що не більше 200 з них мають значення в патології людини, а широкого розповсюдження набули і грають істотну епідеміологічну роль не більше 50. Переважна більшість сальмонел, ізольованих від людей в нашій країні і за кордоном, відносяться до чотирьох серологічних груп - B C D E (98 - 99 %), а до інших 63 серологічних груп - не більше 1 - 2 %.

Проте в світі накопичено чимало фактів про те, що всі відомі сальмонели потенційно патогенні і можуть викликати інфекційний процес у людей, тварин, птахів. Чисельні спостереження указують на те, що будь-який із сероварів сальмонел може стати причиною самих різноманітних клінічних форм хвороби - від тяжких генералізованих форм до безсимптомного носійства. Однак це в більшій ступені відноситься до сальмонел підвиду I. Патогенність для людей сальмонел - представників інших підвидів і виду S.bongori (V) практично не вивчена.

В клінічній практиці немає необхідності зазначати підвид. Необхідним для ідентифікації є тільки назва серовару підвиду enterica. При зазначенні серовару сальмонел перша буква повинна бути заголовною (S.Typhimurium, S.Dublin, S.Moscow і ін.), а при позначенні виду або підвиду - прописна. В звичайній практиці можливо використання двох варіантів назв: Salmonella ser. Typhimurium або Salmonella Typhimurium (скорочено - S.Typhimurium).

Серовари інших підвидів S.enterica або S.bongori позначають тільки номером підвиду і їх антигенною формулою. Наприклад: II-O1,6,14 H, e, n, x, z 15. Це означає, що штам з такою антигенною характеристикою відноситься до виду enterica subsp. Salamae.

4. Відбір та доставка матеріалу
для лабораторного дослідження

4.1. Загальні вимоги

4.1.1. Відбір проб здійснюють з дотриманням правил асептики з метою виключення можливості контамінації їх за рахунок суміжних областей шкіри, інших органів, зовнішнього середовища тощо.

4.1.2. Відібраний біологічний матеріал ретельно упаковують, щоб уникнути контамінації сторонньою мікрофлорою, заповнюють форму 204/о "Направлення на мікробіологічне (бактеріологічне, вірусологічне, паразитологічне) дослідження", затверджену наказом МОЗ України від 04.01.2001 N 1.

4.1.3. Відібрані проби харчових продуктів, інших об'єктів середовища життєдіяльності людини поміщають в стерильний посуд (склянки, пробірки, флакони), нові поліетиленові пакети, стерильний пергаментний папір, ретельно закривають і упаковують, заповнюють форму N 205/о "Направлення на санітарно-мікробіологічне дослідження", затверджену наказом МОЗ України від 04.01.2001 N 1.

4.1.4. Супроводжувальну документацію упаковують окремо від проб. Ємкості з матеріалом повинні бути промарковані відповідно до направлення. Забороняється обертати направлення навколо ємкості з об'єктом досліджень, вкладати в контейнер. Направлення зберігаються в лабораторії протягом терміну, визначеного в установленому порядку.

4.1.5. При направленні проб харчових продуктів, відібраних за епідпоказами, додатково вказують, який з продуктів є підозрюваним, як фактор ризику.

4.1.6. Матеріал для мікробіологічного дослідження в лабораторію доставляють в контейнерах, що виключають пошкодження первинних контейнерів з матеріалом.

4.1.7. Категорично забороняється доставка матеріалу в лабораторію особами, яких обстежують.

4.1.8. Загальні вимоги до відбору, пакування та транспортування матеріалу в лабораторію викладені в ДСП 9.9.5.-080-2002 "Правила влаштування і безпеки роботи в лабораторіях (відділах, відділеннях) мікробіологічного профілю", затверджених постановою Головного державного санітарного лікаря України від 28.01.2002 N 1.

4.2. Відбір та доставка біологічного матеріалу

4.2.1. Матеріалом для мікробіологічних досліджень на наявність сальмонел у людини є: кров, випорожнення, блювотиння, промивні води шлунка, сеча, а при наявності показів - жовч, дуоденальний вміст, ліквор, гній, ексудат; у летальних випадках - секційний матеріал.

4.2.2. Кров для бактеріологічного дослідження, у зв'язку з короткочасністю бактеріємії при сальмонельозах, беруть обмежено і в найбільш ранні строки хвороби, а також повторно у період лихоманки, або в розпалі рецидивів стерильним одноразовим шприцом з ліктьової або іншої вени в об'ємі 2 - 10 см³ в залежності від віку. В більш пізні терміни або при слабо вираженій клінічній картині - 15 - 20 см³. У дітей до одного року кров беруть в доступних кількостях з пальця, п'яти або мочки вуха. Відібрану кров засівають біля ліжка хворого. За вимогою лікаря може бути зроблена бактеріоскопія "товстої краплі".

4.2.3. Випорожнення забирають для дослідження з перших годин захворювання по можливості до початку лікування, особливо антибіотиками; потім - у міру необхідності, протягом усього періоду хвороби і перед випискою зі стаціонару. Варто звернути увагу на забір більш рідких порцій безпосередньо після дефекації. На суднах, горщиках тощо, звідки робиться відбір, не повинно бути слідів дезінфекційних засобів. Забір проводять скляною паличкою, шпателем або ректальною петлею.

При неможливості отримання випорожнень після дефекації матеріал відбирають безпосередньо із прямої кишки за допомогою ректальної петлі або тампона, вводячи його в кишку на 8 - 10 см.

При профілактичному обстеженні здорових осіб з метою виявлення носійства, випорожнення забирають за допомогою одноразових тампонів. При масових обстеженнях допускається використання ректальних петель. Матеріал для дослідження на носійство сальмонел, взятий на дому за відсутності медичного працівника, на дослідження не приймається.

Відібраний матеріал поміщають у стерильний посуд з консервантом; можна використовувати середовище збагачення, але при цьому обов'язково паралельно проводиться прямий посів на щільні поживні середовища.

4.2.4. Блювотиння і промивні води шлунка збирають, при наявності відповідної симптоматики в кількості до 100 см³ у стерильний посуд. Для дослідження відбирають перші порції промивних вод і тільки в тих випадках, коли хворий не отримував для промивання шлунка марганцевокислий калій чи інші бактерицидні засоби.

4.2.5. Сечу у кількості 20 - 30 см³ збирають в стерильний посуд після ретельного туалету сечостатевих органів. Першу порцію сечі для аналізу не беруть. Дослідження проводять при підозрі на черевний тиф або паратифи на 1 - 3 тижні від початку захворювання.

4.2.6. Жовч (дуоденальний вміст) збирають натщесерце при дуоденальному зондуванні у стерильні пробірки. При цьому окремо збирають дуоденальний вміст, пузирну жовч і жовч з жовчних протоків (відповідно порції A, B, C). Кисла реакція, білуватий відтінок, наявність пластівців роблять матеріал непридатним для бактеріологічного дослідження. При оперативному втручанні пробу збирають за допомогою шприца, стерильної піпетки або тампону. Питання необхідності дослідження жовчі вирішує клініцист, з метою контролю формування або наявності бактеріоносійства.

4.2.7. Ліквор підлягає дослідженню при наявності менінгеального або менінгоенцефалітичного синдрому. Пробу (3 - 5 см³) збирають в стерильну пробірку і доставляють в лабораторію, запобігаючи охолодження (використовувати термоконтейнер).

4.2.8. Операційний (пунктати з запальних органів і середовищ) і секційний матеріал (шматочки органів, мезентеріальні вузли, кров, жовч тощо) для дослідження відбирають у разі потреби при оперативних втручаннях або на місці розтину. Маса проби повинна бути не менше 20 г.

4.3. Відбір та доставка проб харчових продуктів і
інших об'єктів середовища життєдіяльності людини

4.3.1. Об'єктами дослідження можуть бути проби харчових продуктів та сировини, відібрані в порядку здійснення державного санітарно-епідеміологічного нагляду, залишки їжі, що вживалася хворими, а також продукти і напівфабрикати, які використовували при її приготуванні; добові проби готової їжі, корми тваринного і рослинного походження, змиви з устаткування і інших предметів, підозрюваних як чинник передачі збудника, вода (питна, відкритих водоймищ, стічна), повітря, грунт тощо.

4.3.2. Проби харчових продуктів для дослідження відбирають відповідно до вимог нормативної документації на конкретні групи та види продуктів.

4.3.3. Залишки консервів направляють в лабораторію безпосередньо в тій банці, з якої їх використовували в їжу. За відсутності залишків консервів дослідженню підлягає вміст 2 - 5 нерозкритих банок з аналогічним маркуванням.

4.3.4. Дрібну рибу відбирають в кількості 2 - 3 штук, у великої вирізують 3 - 4 шматки із спинки, ближче до голови, і з ділянок біля анального отвору загальною масою не менше 200 г.

4.3.5. Солонину і солоні продукти, що знаходяться в бочковій тарі, беруть зверху, з середини і з дна бочки. Загальна маса проби має бути не менше 200 г. У окремий посуд набирають 100 - 200 см³ розсолу.

4.3.6. Проби рідких і напіврідких продуктів і кормів (супи, соуси, замінник цілісного молока (далі - ЗЦМ) відбирають після ретельного перемішування в кількості близько 200 г.

4.3.7. Молочні продукти заводського приготування доставляють в лабораторію в оригінальній упаковці, інші - в об'ємі до 200 см³.

4.3.8. Добові проби направляють для дослідження безпосередньо в тому посуді, в якому вони зберігалися в холодильнику. Залишки фактично спожитої їжі відбирають в тому посуді, в якому їх виявили.

Допускається доставка цих проб в стерильних контейнерах, куди їх перекладають з дотриманням асептики.

4.3.9. Яйця відбирають по 5 шт. з шести різних місць обстежуваної партії; в першу чергу беруть яйця, що зберігалися більше 7 днів.

4.3.10. Для дослідження сухих ЗЦМ відбирають з п'яти мішків однієї партії по 80 - 100 г продукту, який ретельно перемішують і поміщають в стерильну банку. Всього відбирають 4 - 5 збірних проб ЗЦМ.

4.3.11. Відбір змивів проводять з урахуванням вимог ДСТУ ISO 18593:2006 "Мікробіологія харчових продуктів і кормів для тварин. Мікробіологічний аналіз із використанням відбитків і змивів з поверхонь".

Відбір здійснюють стерильними ватяними або ватяно-марлевими тампонами з площі не менше 100 см², в деяких випадках до 1000 см², в пробірки з 2 см³ попереднього середовища збагачення - забуференої пептонної води pH 7,0. Безпосередньо перед узяттям змиву тампон зволожують, нахиляючи пробірку, надлишок вологи віджимають об стінку пробірки.

При відборі змивів з яєчної шкаралупи один тампон використовують для відбору змиву з 10 яєць.

4.3.12. Проби питної води відбирають відповідно до вимог методичних вказівок "Санітарно-мікробіологічний контроль якості питної води", затверджених наказом МОЗ України від 03.02.2005 N 60.

4.3.13. Проби води відкритих водоймищ або стічних вод відбирають відповідно до "Методических указаний по санитарно-микробиологическому анализу воды поверхностных водоемов", затв. МОЗ СРСР 19.02.81 N 2285-81.

4.3.14. Дослідження ґрунту проводять за епідпоказами. Наважку 50 г поміщають в середовище неселективного збагачення в співвідношенні 1:10 і подальше дослідження виконують аналогічно харчовим продуктам.

4.3.15. Визначення наявності сальмонел в повітрі проводять за епідпоказами. Проби відбирають аспіраційним методом за допомогою апаратів і пристроїв, дозволених до застосування в установленому порядку. Кількість пропущеного повітря повинна складати 250 дм³ на одну чашку з диференційно-діагностичним середовищем, наприклад: використовують 2 чашки з агаром Ендо і дві чашки з вісмут-сульфітним агаром. Таким чином, об'єм пропущеного через апарат повітря складає 1000 дм³.

5. Порядок проведення дослідження на сальмонели

Дослідження на сальмонели складається з наступних етапів.

Підготовка матеріалу до дослідження.

Первинний посів (середовища збагачення, диференційно-діагностичні середовища).

Відбір підозрілих колоній, отримання чистих культур.

Ідентифікація виділених культур за біохімічними та серологічними властивостями. Визначення біохімічних та серологічних варіантів.

Визначення чутливості до антибіотиків, дезінфекційних засобів (при необхідності).

Слід зазначити, що при дослідженні різних матеріалів відрізняються тільки початкові етапи аналізу (правила забору матеріалу, його обробка, вибір адекватних поживних середовищ). Починаючи з відбору колоній на диференційно-діагностичних середовищах, подальші етапи бактеріологічного дослідження ідентичні.

5.1. Підготовка проб біологічного матеріалу
до дослідження і первинний посів

5.1.1. Ефективність дослідження, направленого на виділення сальмонел з різних матеріалів, в першу чергу залежить від застосування відповідних середовищ збагачення і адекватних диференційно-діагностичних середовищ.

Перевагу слід віддавати поживним середовищам комерційного виготовлення. У тих випадках, коли рекомендовані середовища відсутні, їх готують в лабораторних умовах. Приготування та контроль поживних середовищ здійснюють з урахуванням вимог ДСТУ ISO/TS 11133-1:2005 "Мікробіологія харчових продуктів і кормів для тварин. Настанови щодо готування та виробництва поживних середовищ. Частина 1. Загальні настанови щодо виготовлення поживних середовищ гарантованої якості в лабораторії" та ДСТУ ISO/TS 11133-2:2006 "Мікробіологія харчових продуктів і кормів для тварин. Настанови щодо готування та вироблення поживних середовищ. Частина 2. Практичні настанови щодо випробування культуральних середовищ".

5.1.2. Рекомендовані середовища збагачення діляться на неселективні первинні (забуферена пептонна вода) і середовища селективного збагачення, наприклад: магнієве, селенітове, Мюллера-Кауфмана (тетратіонатне середовище), Раппапорта-Василіадіса, селеніт-цистинове. В деяких випадках доцільно використовувати слабо-селективне середовище - 10 - 20 % жовчний бульйон.

5.1.3. Диференційно-діагностичні середовища у свою чергу діляться на слабоселективні і високоселективні. Прикладами слабоселективних є - агар Ендо, агар Мак-Конки, бриліант-грюн агар, високоселективних - агар Плоскірева, SS-агар, ксилозолізин дезоксихолат агар, вісмут-сульфітний агар.

В сучасній мікробіологічній практиці широко використовуються. При цьому утворюються забарвлені і/або флюоресцюючі продукти. Внаслідок цього колонії мікроорганізмів забарвлюється в певний колір або набувають здібності до флюоресценції при ультрафіолетовому опромінюванні.

При застосуванні хромогенних середовищ виділення чистої культури і її орієнтовна ідентифікація можуть бути здійснені вже протягом першої доби дослідження.

Характер росту сальмонел на щільних середовищах первинного посіву наведений в таблиці 3.

5.1.4. Зразки біологічного матеріалу, що надійшли на дослідження до лабораторії, реєструють і готують для посіву в середовища збагачення і на чашки Петрі з диференційно-діагностичними середовищами.

Безпосередній висів матеріалу з середовища збагачення до інкубації в термостаті може замінити прямий посів на диференційно-діагностичні середовища.

5.1.5. Випорожнення, доставлені у фосфатно-буферному розчині, висівають в середовище збагачення подвійної концентрації в співвідношенні 1:1. Матеріал, доставлений в гліцериновому консерванті або транспортному середовищі, засівають в середовище збагачення в співвідношенні 1:10. Випорожнення, доставлені без консерванту, суспендують в середовищі збагачення в співвідношенні 1:5. З вказаних суспензій роблять висів на диференційно-діагностичні середовища, частину, що залишилася, інкубують в термостаті.

5.1.6. Кров, узяту з вени, висівають в подвійне середовище. У разі крайньої необхідності посіви проводять в 10 - 20 % жовчний бульйон. Після 16 - 20 годин інкубації роблять висів на одне з диференційно-діагностичних середовищ. При негативному результаті висів повторюють на 3, 5, 8 добу.

Оптимально використовувати комерційні системи для виділення гемокультур. При цьому слід користуватися інструкцією про застосування конкретної системи.

5.1.7. Кожну фракцію жовчі (дуоденального вмісту) висівають у флакони із слабо лужним поживним бульйоном в співвідношенні 1:10 і на диференційно-діагностичні середовища. Через 18 - 24 год. з флаконів здійснюють повторний висів на диференційно-діагностичні середовища. У разі отримання негативних результатів висів повторюють на 3, 5, 7 добу, використовуючи слабо-селективні середовища.

5.1.8. Блювотиння і промивні води шлунку. У випадку кислої реакції блювотиння (pH<4,5), його перед посівом нейтралізують 10 % розчином натрію бікарбонату (pH 7,0 - 7,4), промивні води центрифугують 15 хвилин при 3000 об/хвилину. Осад висівають в середовища збагачення. У випадку неможливості центрифугування роблять посів нативного матеріалу в середовище збагачення подвійної концентрації у співвідношенні 1:1 і після 18 - 24 год. інкубації роблять висів на диференційно-діагностичні середовища.

5.1.9. Сеча. Пробу сечі центрифугують 15 хвилин при 3000 об./хвилину. Осад висівають в середовища збагачення. У випадку неможливості центрифугування допускається посів нативного матеріалу в середовища збагачення подвійної концентрації в співвідношенні 1:1 і після 18 - 24 год. інкубації роблять висів на диференційно-діагностичні середовища.

5.1.10. Операційний і секційний матеріал розтирають у ступках і висівають в одне з середовищ збагачення (переважно магнієве або селенітове) у співвідношенні 1:5, одночасно роблять прямий посів на диференційно-діагностичні середовища.

5.1.11. За наявності іншого клінічного матеріалу його висівають на два-три диференційно-діагностичних середовища (комбінуючи високо- і низькоселективні) і, одночасно, в середовища збагачення.

5.1.12. Середовища в чашках Петрі підсушують. Для забезпечення росту ізольованих колоній на їх поверхні не повинна залишатися конденсаційна волога.

5.1.13. На щільні поживні середовища досліджуваний матеріал наносять за допомогою бактеріологічної петлі (матеріал від хворих), піпетки, скляної палички або тампона (проби продуктів і змиви) з подальшим втиранням матеріалу шпателем по всій поверхні середовища. На високоселективні середовища посівний матеріал наносять у великому об'ємі, у 3 - 5 разів більше, чим на слабоселективні.

5.1.14. Посіви інкубують в термостаті при (37±1) °C, за виключенням посівів на середовищах збагачення Раппапорта-Василіадіса, Мюллера-Кауфмана, які інкубують відповідно до інструкції про застосування при температурі 42 - 43 °C.

5.1.15. Після інкубації посівів на середовищах збагачення роблять повторний висів на диференційно-діагностичні середовища з подальшим відбором підозрілих колоній.

5.2. Підготовка проб з об'єктів середовища життєдіяльності
людини до дослідження і первинний посів

5.2.1. При дослідженні проб продуктів і кормів роблять наважки масою 25 г.

5.2.2. Харчові продукти, бактеріологічне дослідження яких проводять відповідно до вимог "Мікробіологічних нормативів і методів аналізу продуктів дитячого, лікувального і дієтичного харчування і їх компонентів" (М., 1988), "Нормативів і методів мікробіологічного контролю продуктів дитячого харчування, виготовлених на молочних кухнях системи охорони здоров'я" (М., 1988), "Медико-біологічних вимог до якості продовольчої сировини і харчових продуктів" (М., 1989), беруть для дослідження в кількості, передбаченій у вказаних документах.

5.2.3. Дослідження проводять з урахуванням вимог ДСТУ ISO 6579 "Мікробіологія харчових продуктів і кормів для тварин. Методика виявлення Salmonella spp. ", молоко та молочні продукти - ДСТУ IDF 93A:2003 "Молоко і молочні продукти. Визначання Salmonella".

5.2.4. Підготовлені проби харчових продуктів висівають в неселективне середовище збагачення в співвідношенні 1:10 і одночасно роблять посів матеріалу з вказаного середовища до його інкубації на диференційно-діагностичні середовища, використовуючи одну чашку з низькоселективним середовищем і одну з високоселективним.

5.2.5. Після інкубації посівів на неселективному середовищі збагачення матеріал пересівають в два середовища селективного збагачення. При цьому має дотримуватися наступне співвідношення посівної дози і об'єму середовища збагачення. Для всіх вказаних середовищ збагачення воно складає 1 см³ надосадової рідини на 10 см³ середовища і інкубації 18 - 20 годин при (37±1) °C. Для середовища Мюллера-Кауфмана 1 см³ надосадової рідини на 10 см³ середовища, для середовища Раппапорта-Василіадіса - 0,1 см³ з неселективного середовища збагачення (забуференной пептонної води) в 10 см³ вказаного середовища, інкубація 18 - 24 год. при (42±1) °C.

5.2.6. Після інкубації на середовищах селективного збагачення проводять висів на чашки Петрі з вісмут-сульфітним агаром та обов'язково на середовище Ендо.

5.2.7. Проби кормів висівають в попереднє середовище збагачення в співвідношенні 1:5 - 1:10 залежно від здібності до набухання і інкубують 5 год. в термостаті, після чого збовтують, відстоюють. Надосадову рідину пересівають в співвідношенні 1:5 в друге середовище збагачення і поміщають в термостат. Набряклі корми рослинного походження заливають другим середовищем збагачення так, щоб вона покрила поверхню проби.

5.2.8. Продукти щільної консистенції гомогенізують з невеликою кількістю попереднього середовища збагачення, яке потім додають в кількості, що забезпечує співвідношення 1:10.

5.2.9. Крем, вершкове масло і т. п. перед посівом розплавляють у водяній бані за температури (45±1) °C, струшуючи під час розплавлення, і негайно виймають із водяної бані після повного розплавлення.

5.2.10. Морозиво готують аналогічно, але використовують водяну баню з температурою не вище 37 °C.

5.2.11. Рідкі об'єкти, що мають кислу реакцію pH<4,5, перед посівом нейтралізують 10 % стерильним розчином бікарбонату натрію до слаболужної реакції (pH 7,0 - 7,4).

5.2.12. При дослідженні яєць шкаралупу обробляють спиртом і обпалюють, після чого яйця розбивають і відокремлюють жовток в стерильний посуд, об'єднуючи п'ять жовтків однієї проби. Жовтки гомогенізують і використовують для посіву.

5.2.13. Проби м'яса тварин і птахів, яєчного порошку, меланжу і консерви в закритих банках досліджують відповідно до діючих ГОСТ та ДСТУ.

5.2.14. Посіви змивів в попередньому середовищі збагачення після інкубації в термостаті пересівають в друге середовище збагачення: в пробірку з посівом змиву додають 10 см³ другого середовища збагачення і поміщають в термостат на 18 - 20 год. Після інкубації роблять висів з другого середовища збагачення на диференційно-діагностичні з подальшим відбором підозрілих колоній і їх ідентифікацією.

5.2.15. При дослідженні води питної, поверхневих водних об'єктів і стічних вод беруть 2 проби по 500 см³ кожна і вносять до рівного об'єму селективного середовища збагачення подвійної концентрації. При використанні методу мембранної фільтрації одержані фільтри поміщають в 50 см³ кожного з двох середовищ накопичення, наприклад магнієвого і селенітового, або середовища Раппапорта-Василіадіса і селенітового. Після інкубації роблять висів на диференційно-діагностичні середовища.

5.2.16. Посіви на диференційно-діагностичних середовищах інкубують в термостаті при температурі (37±1) °C 18 - 20 год., а чашки з вісмут-сульфітним агаром - 48 год. з попереднім переглядом через 24 години.

6. Ідентифікація сальмонел

6.1. Визначення біохімічних властивостей

6.1.1. Переглядають посіви на щільних поживних середовищах неозброєним оком або за допомогою лупи в денному або штучному світлі, що проходить (посіви на чашках Петрі з вісмут-сульфитним агаром проглядають в світлі, що падає) і відзначають колонії, за морфологічними властивостями схожі на сальмонельозні.

6.1.2. Якщо на чашках первинного посіву підозрілі колонії відсутні, відповідь видають тільки після обліку результатів висівів із середовищ збагачення. Якщо і при висіві із середовищ збагачення підозрілих колоній не виявлено, може бути видана відповідь про негативний результат дослідження.

6.1.3. У випадку, якщо в результаті прямого посіву випорожнень не виросло жодної колонії, варто отримати матеріал для досліджень ще раз.

6.1.4. Розмір колоній на щільних поживних середовищах при посіві помірної густоти сягає 1 - 2 мм, але зустрічаються і карликові колонії.

Таблиця 3. Характер росту сальмонел на різних
диференційно-діагностичних середовищах

6.1.5. Колоніям S.Paratyphi B, S.Abortusequi, S.Tyhisuis та деяких інших сальмонел, при зберіганні посівів протягом 1 - 2 діб при кімнатній температурі, властива здатність до валоутворення, яка виражається у тому, що зовнішні краї колонії злегка піднімаються, утворюючи слизуватий вал. Ця ознака використовується для диференціації S.Paratyphi B від її біохімічного варіанту S.Java, що не утворює вал при рості на агарі.

6.1.6. Пересівають 3 - 5 підозрілих колоній у пробірки із комбінованими середовищами - трицукровий агар Олькеницького (Кліглера). Посів роблять спочатку штрихами по скошеній частині, а потім уколом у середину стовпчика. Для прискорення дослідження, особливо при ускладненні епідемічної ситуації, підозрілі колонії, паралельно відсівають ще і на скошений м'ясо-пептонний агар для подальшої постановки реакції аглютинації. Результати цієї реакції орієнтовні і потребують підтвердження на етапі завершення біохімічної ідентифікації.

6.1.7. Пробірки з посівами інкубують у термостаті при температурі (37±1) °C до наступного дня.

6.1.8. Проводять попередню ідентифікацію культур, за характером росту на середовищі Олькеницького (Кліглера), по ферментації лактози, глюкози, сахарози, гідролізу сечовини, утворенню сірководню, а також за серологічними властивостями, які визначають у реакції аглютинації на склі з полівалентними сироватками.

6.1.9. Про ферментацію лактози (і сахарози) в середовищі Олькеницького і ферментацію лактози в середовищі Кліглера судять по появі жовтого забарвлення в скошеній частині агару, а про ферментацію глюкози - по такому ж забарвленню в стовпчику. Газоутворення встановлюють по наявності бульбашок газу і розриву агару, утворення сірководню - по почорнінню середовища. Якщо культура гідролізує сечовину, середовище Олькеницького набуває дифузного яскравого червоно-малинового забарвлення.

6.1.10. Якщо культури ферментують лактозу і глюкозу з утворенням газу і гідролізують сечовину, вони не належать до бактерій роду Salmonella.

6.1.11. Культури, що не ферментують лактозу і не гідролізують сечовину, але ферментують глюкозу (з утворенням чи без утворення газу), утворюють сірководень, піддають подальшому вивченню на належність до роду Salmonella.

6.1.12. Культури, що не ферментують лактозу, ферментують глюкозу без газоутворення, не утворюють сірководень і не гідролізують сечовину, підозрілі як паратифозні чи шигельозні. Їх випробовують у реакції аглютинації з полівалентними сальмонельозними та шигельозними сироватками і подальше вивчення роблять в залежності від результату аглютинації.

6.1.13. Культури, що не ферментують лактозу, ферментують глюкозу з утворенням газу, не утворюють сірководню і позитивні в реакції аглютинації з полівалентними сальмонельозними сироватками можуть належати до роду Salmonella.

6.1.14. У підозрілих культур вивчають морфологію, тинкторіальні властивості, ферментативні характеристики, що дозволяють визначити родову належність виділених бактерій. З цією метою використовують тести, що дозволяють визначити здібність до утворення індолу, росту на середовищах з цитратами, розкладання сечовини, саліцину, малонату натрію, наявність лізин-декарбоксилази, фенілаланіндезамінази, здібність до утворення ацетил-метил-карбінолу в реакції VP. Ставлять також пробу з MR і визначають рухливість.

Таблиця 4. Біохімічні властивості родів родини
Enterobacteriaceae, що зустрічаються найчастіше

Умовні позначення:

"+" - ферментація середовища

"-" - середовище не ферментується

"+,-" - середовище ферментується, деякими варіантами не ферментується

"-,+" - середовище не ферментується, деякими варіантами ферментується

"Х" - варіанти стосовно даної ознаки.

6.1.15. Сальмонели не утворюють індол, здатні рости на середовищах з цитратами, декарбоксилувати лізин (за винятком деяких штамів S.Typhimurium, S.Enteritidis), не мають фенілаланіндезаміназ, не розкладають сечовину, негативні в реакції VP, позитивні в пробі з MR, рухливі (за винятком S.Gallinarum). Переважна більшість сальмонел не ферментує саліцин.

6.1.16. Для визначення родової належності культур, отримання відтворюваних результатів доцільно для біохімічної ідентифікації використовувати діагностичні системи та набори для ідентифікації ентеробактерій, наприклад Api20E, ЕНТЕРОтест тощо, аналізатори БакТрак, Vidas, mini-Vidas і інші прилади, що пройшли відповідні випробування, зареєстровані і дозволені до застосування в Україні.

6.1.17. При виділенні культур грамнегативних рухливих паличок, що ферментують глюкозу з утворенням або без утворення газу, не ферментують лактозу і сахарозу, не гідролізують сечовину, не утворюють індол, утворюють сірководень, мають інші характерні для цього роду біохімічні властивості і чітку серологічну характеристику - видають відповідь про виділення сальмонел.

6.1.18. Чутливість сальмонел до антибіотиків визначають відповідно до методичних вказівок МВ 9.9.5-143-2007 "Визначення чутливості мікроорганізмів до антибактеріальних препаратів", затверджених наказом МОЗ України від 05.04.2007 N 167.

6.1.19. Визначення біохімічних варіантів культур сальмонел проводять відповідно підрозділу 6.3 цих методичних вказівок.

6.2. Проба з бактеріофагом

6.2.1. У разі труднощів з ідентифікацією, для підтвердження належності культури до роду Salmonella, можна поставити пробу з бактеріофагом, використовуючи лікувальний сальмонельозний O-бактеріофаг (далі O-фаг).

Для цього дві краплі 4 або 18 годинної бульйонної культури досліджуваного штаму наносять тонко відтягнутою пастерівською піпеткою або петлею (діаметр 0,4 - 0,5 мм) на добре підсушений слабко лужний агар у чашці Петрі. Після підсихання на одну з крапель, петлею або пастерівською піпеткою меншого діаметру, наносять O-фаг у робочому розведенні, зазначеному на етикетці, а на іншу - краплю бульйону (контроль). На одній чашці, таким чином, можна випробувати одночасно 5 - 6 культур. Чашки з нанесеними культурами і O-фагом поміщають у термостат при (37±1) °C на 18 - 20 годин, після чого проводять облік результатів.

6.2.2. Поява на місці нанесення O-фага чітко обмеженої зони зливного лізису або більшого чи меншого числа негативних колоній, чітко видимих неозброєним оком, свідчить про чутливість культур до O-фагу. За відсутності лізису в місцях нанесення O-фага буде суцільний ріст культури, як у контролі.

6.2.3. O-фаг може бути використаний для попереднього дослідження культури з чашки з диференційним середовищем.

6.2.4. Культура, що лізується O-фагом, є підозрілою на сальмонелу і може бути прямо з чашки випробувана в реакції аглютинації із полівалентними сальмонельозними O-сироватками.

6.2.5. O-фаг лізує майже 98 % відомих штамів сальмонел. Найбільш часто резистентні S.Derby, S.Tennessee, S.Anatum, S.London і деякі інші.

6.2.6. Атипові культури сальмонел в більшості випадків чутливі до O-фагу, у той час як культури подібні із сальмонелами за біохімічними властивостями, як правило, не лізуються O-фагом. Слід мати на увазі, що в 0,3 % випадків позитивну пробу з O-фагом можуть давати представники інших родів родини Enterobacteriaceae.

6.3. Визначення біохімічних варіантів сальмонел

Деякі з найбільш розповсюджених сероварів володіють різною ферментативною активністю відносно окремих біохімічних тестів, що використовується для епідемічного маркування. Типування можна здійснювати за будь-якою комбінацією тестів, по відношенню до яких виявлені варіабельні властивості у штамів одного серовару. У таблицях 5-8 надані схеми типування найбільш розповсюджених сероварів сальмонел.

Таблиця 5. Скорочена схема визначення
біоварів S.Typhimurium

Таблиця 6. Схема визначення
біоварів S.Typhimurium (повна схема)

Тест з мукатом враховують через 48 - 96 год. по зміні кольору. Позитивний результат - зміна вихідного кольору середовища (синє з зеленуватим відтінком) на зеленувато-жовтий.

Тест з тартратами враховують через 48 - 96 год. по зміні кольору та величині осаду, що випав протягом 30 хвилин після додавання насиченого водного розчину ацетату свинцю. При позитивному результаті осад незначний і не перевищує 1/4 об'єму середовища, при негативному - займає 1/2 або більше об'єму. Облік результатів росту в бульйоні Штерна роблять до 7 днів.

Таблиця 7. Схема визначення біоварів S.Typhi

Таблиця 8. Схема визначення
біоварів S.Enteritidis і S.Dublin

Умовні позначення

"*+" - позитивна реакція протягом 1 - 2 діб;

"(+)" - позитивна реакція пізніше 3 діб;

"(+)" або "-" - позитивна реакція пізніше 3 діб або негативна;

"-" - негативна реакція;

"X" - різні реакції;

"** ++" - фіолетове забарвлення середовища;

"+" - фіолетово-червоне забарвлення середовища;

"-" - колір середовища не змінюється

В деяких випадках для точного визначення серовару (біовару) необхідно визначення додаткових біохімічних властивостей виділеної культури у зв'язку з тим, що окремі серовари мають ідентичну антигенну структуру і розрізняються лише за ферментативними властивостями (таблиця 9).

Таблиця 9. Характеристика біохімічних і серологічних
ознак деяких сальмонел

6.4. Серологічна ідентифікація сальмонел

6.4.1. Серотипування штамів сальмонел включає виявлення соматичного антигена (O-антигени сальмонел), що є ліпополісахаридом (ЛПС), і джгутикових антигенів (H-антигени), представлених термолабільними білками. Визначення сероварів засноване на антигенній комбінації окремих O- і H-антигенів.

Більшість сальмонел мають H-антигени двох фаз, їх називають двофазними. Наприклад - S.Typhimurium, антигенна формула - O:1,4,5,12; H:i; 1.2. Відомі монофазні - наприклад: S.Cholerasuis var.kunsendorf - антигенна формула - O:6,7; H:1,5 - відсутня перша фаза H-антигену, S.Enteritidis, антигенна формула - O:1,9,12; H:gm - відсутня друга фаза H-антигену); безфазні - нерухомі, наприклад: S.Gallinarum (антигенна формула O:1,9,12 - повна відсутність H-антигену.

6.4.2. Визначення O-антигенів виділених мікроорганізмів. Визначення O-антигена проводиться в реакції аглютинаціі на склі. Сироватка містить антитіла до O-антигенів сальмонел, які утворюють аглютинат з бактеріями, що мають відповідні антигени.

6.4.3. Сухі сальмонельозні O-сироватки розчиняють відповідно до інструкції про застосування.

6.4.4. На предметне скло піпеткою наносять краплю O-сироватки і краплю ізотонічного розчину хлориду натрію. Поблизу краплі ізотонічного розчину хлориду на (на відстані 2 - 3 мм) наносять петлю культури, вирощеної протягом 18 - 24 годин на скошеному поживному агарі при температурі (37±1) °C, і емульгують її в розчині за допомогою петлі протягом 1 хвилини (контроль спонтанної аглютинації). Облік результатів реакції проводять за допомогою лупи із збільшенням (2х).

За відсутності спонтанної аглютинації маніпуляцію повторюють в краплі O-сироватки, формуючи рівномірну непрозору суспензію. Облік результатів проводять протягом 1 - 2 хвилин, м'яко похитуючи скло. Гомогенна суспензія свідчить про негативний результат. Утворення через кілька секунд (або 1 хвилини) пластівців аглютинату, що формується у середині краплі на фоні її прояснення, розцінюють як позитивний результат.

6.4.5. Штами, що знаходяться в "шорсткій" R-формі, володіють спонтанною аглютинацією. Їх подальше серотипування не представляється можливим без додаткових маніпуляцій. Такі штами пересівають на слаболужний агар або проводять 1 - 2 пасажі культури на агарі Мюллера-Хинтона чи кров'яному агарі для того, щоб вибрати колонію з рівними краями і повернути штам в "S" форму і повторюють аглютинацію. Якщо аглютинація з полівалентними O-сироватками не відбувається, маловірогідно, що штам належить до роду Salmonella.

6.4.6. Серологічну ідентифікацію сальмонел починають з випробовування їх у реакції аглютинації на склі із полівалентною сироваткою АВСДЕ, що включає в себе аглютиніни до O-антигенів 2, 4, 6₁, 6₂, 7, 8, 9 і 3 - 10, 12, Vi. При відсутності реакції аглютинації з зазначеною сироваткою, культуру випробовують із полівалентною сироваткою "рідких груп" сальмонел, що включає антитіла до антигенів 11, 13 - 22, 14 - 34, 15, 19, 23 та ін.

6.4.7. При отриманні позитивного результату реакції аглютинації з полівалентною сироваткою ABCDE переходять до визначення O-групи сальмонел за допомогою моновалентних O-сироваток - 2; 4; 6₁; 6₂; 9; 3, 10.

6.4.8. Після встановлення належності культури до O-групи визначають наявність інших O-антигенів, що характеризують сальмонели даної серологічної групи. Визначення повного комплексу O-антигенів культури, що вивчається, є обов'язковим, так як дає змогу встановити серологічну підгрупу (наприклад, в серологічних групах C та E), що необхідно для вирішення наступної задачі - визначення серологічного варіанта збудника. Крім того, випробування з "додатковими" O-сироватками (O1, O5, O12) дозволяє, в межах серологічних груп A, B та D, виявити серологічні варіанти, які, в ряді випадків, мають важливе значення для епідеміологічного аналізу. Наприклад: в групі B - серологічні варіанти без 5-рецептора - у S.Typhimurium (var. Copenhagen).

Культуру, що дає аглютинацію з сироваткою O13, досліджують з сироватками O1, 22, 23 (серологічна група G).

Для встановлення антигенної формули деяких сероварів із групи C₁ і D₁ необхідно проводити випробування культури з Vi-сироваткою для виявлення Vi-антигена (S.Typhi, S.Dublin і S.Paratyphi C).

6.4.9. Віднесення виділеної культури до тієї або іншої серологічної групи зазвичай не викликає особливих труднощів, зокрема у відношенні найбільш розповсюджених сальмонел серологічних груп A, B, C, D, E. Переважна більшість сальмонел (біля 98 %), що циркулюють, належить до перших п'яти серологічних груп - O:2 (A), O:4 (B), O:7 (C₁), O:8 (C₂ - C₃), O:9 (D), O: 3,10 (E) і лише біля 2 % - до інших серологічних груп.

6.4.10. Необхідно враховувати, що в останньому виданні схеми Кауфмана-Уайта (2001 р.) серовари сальмонел, які мають одну і ту ж антигенну структуру і відрізняються тільки по деяких біохімічних характеристиках, об'єднані в один серовар (S.Isangi об'єднана з S.Mission, S.Gallinarum з S.Pullorum, S.Paratyphi B з S.Java). Окрім цього, O-група E₁ об'єднана з O-групою E₂ і E₃, група O:64 об'єднана з O-групою O48.

6.4.11. При відсутності аглютинації з полівалентною O-сироваткою ABCDE і позитивною реакцією аглютинації з полівалентною O-сироваткою "рідких груп", перед подальшим визначенням серологічної характеристики культури необхідно біохімічними тестами підтвердити її належність до одного із підвидів сальмонел (згідно таблиці 1). Якщо досліджувана культура за зазначеними раніше ознаками може бути віднесена до одного із підвидів, то проводять визначення її антигенної структури за допомогою моновалентних O-сироваток "рідких груп".

6.4.12. Нерідко, серед культур, що дають позитивну реакцію аглютинації з сумішшю O-сироваток "рідких груп", зустрічаються штами, які позитивно реагують на склі не з однією, а з двома або більше сироватками, що входять до складу суміші (що відповідають двом або кільком серологічним групам), або не аглютинують ні однією з O-сироваток, що входять до суміші. Зазвичай, такі культури не аглютинуються H-сироватками.

Такі культури досліджують на здатність ферментувати саліцин, малонат натрію, адоніт, дульцит, сорбіт, а також у реакціях VP та MR. За допомогою цих тестів вдається диференціювати бактерії роду Salmonella від представників інших родів родини Enterobacteriaceae, що мають що мають ідентичні або спільні O-антигени із сальмонелами "рідких груп".

6.4.13. При відсутності чіткої аглютинації з O-сироваткою рекомендовано провести повторні (4 - 5) пасажі культури на 10 % жовчному бульйоні і скошеному агарі, після чого розсіяти її на чашку із слаболужним агаром з наступним відбором окремих колоній і випробуванням їх в реакції аглютинації.

6.4.14. Після встановлення належності культури до визначеної O-групи її випробовують з H-сироватками спочатку першої, а потім - другої фази і у такий спосіб встановлюють антигенну формулу виділеної культури, тобто її серологічний варіант. Починати слід з H-сироваток, що відповідають більш розповсюдженим серологічним варіантам сальмонел даної групи.

6.4.15. Для аглютинації з O-сироваткою культуру варто брати з верхньої частини росту на скошеному агарі, для аглютинації з H-сироватками - із самої нижньої частини росту культури чи з конденсату, де розташовуються мікроорганізми з найбільш розвинутим H-антигеном.

6.4.16. При ідентифікації культур, підозрілих на сальмонели, найчастіше викликають труднощі при вивченні бактерій біохімічно подібних до сальмонел, але які не дають аглютинацію з сальмонельозними сироватками, або які дають аглютинацію, але мають відхилення за біохімічними властивостями.

У таких випадках, насамперед, необхідно переконатися в чистоті культури, для чого її розсівають на середовищі Ендо, відбирають найбільш типові колонії і піддають їх додатковому вивченню.

6.4.17. Посів культури в рідке середовище, що містить підвищену кількість лактози (4 %) і знижену кількість пептону (0,3 - 0,5 %), дозволяє в більш ранній термін виявити відношення до лактози.

6.4.18. При серологічній ідентифікації культур можливі труднощі в виявленні H-антигену або однієї з його фаз. Це може бути пов'язано із складною будовою джгутикового антигену (наявність в культурі двох фаз - "специфічної" або першої фази і "неспецифічної" - другої), з пригніченням або втратою H-антигену (втрата рухливості), або з переважанням в популяції бактерій з переважним вмістом якої-небудь однієї фази.

6.4.19. В більшості випадків рухливість сальмонел, а отже і можливість визначення H-антигена, може бути відновлена за допомогою ряду прийомів:

а) масивний засів добової агарової культури на непідсушену чашку з напіврідким (0,8 - 0,9 %) агаром (петлею в центр агарової пластинки), з наступним пересівом культури з периферії макроколонії, що виросла, в пробірку з бульйоном і потім в напіврідкий агар;

б) пасажі через жовчний бульйон;

в) пасажі молодих 2 - 3 годинних культур послідовно через цукровий і м'ясо-пептонний бульйони протягом 2 - 3 днів (на ніч бульйон залишають при кімнатній температурі) з наступним пересівом, культури в пробірку з напіврідким (0,3 %) агаром;

г) посів в напіврідкий (0,3 %) агар уколом і збереження пробірки при кімнатній температурі протягом декількох днів. При розповсюдженні росту від уколу до країв пробірки, проводиться пасаж цього "периферичного росту" через бульйон і напіврідкий агар;

д) відбір з чашки Ендо 10 - 20 ізольованих колоній і посів їх бляшками на чашку з 1 % м'ясо-пептонним агаром. Через 18 - 24 години аглютинують, відбираючи матеріал з краю кожної бляшки.

6.4.20. Для відновлення однієї з фаз джгутикового антигену існує декілька методів, які базуються на тому, що присутність гомологічної сироватки стримує розвиток відповідної фази H-антигена. Якщо культуру вирощувати в поживному середовищі (зазвичай в напіврідкому агарі), до якого додана монорецепторна H-сироватка, гомологічна виявленій фазі H-антигену, розвиток останньої частково (або повністю) пригнічується, що сприяє розвитку протилежної фази.

Метод Свена Гарда. Принцип його полягає в тому, що на напіврідкому агарі (0,8 - 1 %) рояться всі рухливі мікроорганізми. Якщо додати до агару 1 - 2 краплі сироватки відомої (визначеної) фази, вона зв'яже виявлений антиген, а мікроорганізми, багаті іншим, невідомим антигеном будуть активно роїтися. Цей антиген може бути виявлений при дослідженні культури, взятої з краю макроколонії, у реакції аглютинації з H-сироватками.

Існує два способи додавання сироватки в агар:

1. Охолоджений до 45 °C 0,8 - 1,0 % поживний агар розливають в чашки Петрі, після його застигання підсушують протягом 15 - 20 хвилин в термостаті при (37±1) °C. У центр чашки на агар наносять 1 - 2 краплі сироватки, яка відповідає виявленій фазі H-антигену. Після того, як сироватка вбирається в агар, на те ж місце петлею засівають 18 - 20-годинну досліджувану культуру на площу діаметром 3 - 4 мм.

2. До розтопленого і злегка охолодженого 0,8 - 1,0 % поживного агару додають 4 - 5 крапель монорецепторної H-сироватки, гомологічної встановленій фазі H-антигена. Відразу після додавання сироватки і ретельного перемішування агар виливають в стерильну чашку Петрі малого діаметру (наприклад, 40 мм). В центр агарової пластинки обережним дотиком петлі наносять культуру, узяту з нижньої вологої частини скошеного агару.

Далі, незалежно від способу додавання сироватки в агар, чашки з посівом інкубують при (37±1) °C протягом 18 - 24 годин. Наступного дня беруть культуру з краю макроколонії і випробовують її в реакції аглютинації на склі з відповідними монорецепторними H-сироватками.

Метод Хайна. Використовують U-подібну трубочку Хайна, заповнену напіврідким (0,2 - 0,4 %) слаболужним агаром, змішаним з H-сироваткою до антигену пригнічуваної фази. Культуру засівають в один кінець трубочки, при цьому ріст в протилежному від посіву кінці буде обумовлений рухливими мікроорганізмами, що володіють невиявленою раніше фазою H-антигена, які і досліджують в реакції аглютинації.

Метод Крейджі. До стерилізації в бактеріологічну пробірку з напіврідким агаром (5 - 10 см³) поміщають трубочку - відрізок скляного дроту, при цьому верхній кінець повинен виступати над стовпчиком агару. Після стерилізації в охолоджене до 50 °C середовище додають у внутрішню трубочку 0,5 см³ H-сироватки пригнічуваної фази. Після застигання середовища досліджувану культуру засівають уколом в трубочку і інкубують при (37±1) °C 18 - 24 години. Для аглютинації беруть культуру, що виросла на поверхні середовища за межами трубочки.

Метод Джеймсона. Стерильний фільтрувальний папір шириною в 1 см та довжиною 4 - 5 см повністю просочується аглютинуючою сироваткою H фази, з якою культура дала аглютинацію для її пригнічення. В чащі Петрі з МПА вирізається канавка стерильним скальпелем шириною в 1 см та довжиною 4 - 5 см, після чого стерильним пінцетом на неї накладається просочена сироваткою смужка фільтрувального паперу у вигляді містка. На один кінець просоченої смужки паперу бактеріологічною петлею наноситься досліджувана культура сальмонел бляшкою так, щоб половина її була засіяна на агар і половина - на край паперу. Чашка інкубується при 37 °C від 48 до 72 год. Коли з протилежного кінця смужки з'являється ріст засіяної культури, її пересівають на скошений МПА, вирощують 18 - 24 год. при 37 °C.

7. Серологічні методи діагностики сальмонельозів і
виявлення бактеріоносійства

7.1. Використання РПГА для діагностики сальмонельозів має допоміжне значення, оскільки антитіла до антигенів сальмонел можуть бути присутніми в крові практично здорових людей. Внаслідок цього поняття "діагностичного титру" антитіл носить достатньо умовний орієнтовний характер. Слід враховувати і те, що для різних регіонів величина "діагностичного титру" буде різною, що пов'язане з територіальними особливостями епідемічної ситуації. Істотно більше діагностичне значення має наростання рівня антитіл в динаміці захворювання, для чого сироватку потрібно брати відразу після виявлення хворого, а потім в кінці першого або на початку другого тижня хвороби. У пізніші терміни захворювання титр антитіл знижується, що також може служити діагностичним критерієм.

7.2. Парні сироватки повинні досліджуватися одночасно (для цього перша сироватка до дослідження повинна зберігатися в замороженому вигляді).

7.3. Умовно-діагностичним титром вважається титр не нижче 1:320 для дорослих, 1:80 для дітей до 6 міс. і 1:160 для дітей старше 6 міс.

7.4. Позитивним наростанням титру антитіл вважається його чотирикратне збільшення по відношенню до одного і того же антигену.

7.5. При серологічній діагностиці сальмонельозів велике діагностичне значення мають імуноглобуліни, утворення яких обумовлює наростання титру антитіл в крові осіб, інфікованих сальмонелами в певні періоди життя. При цьому найбільш специфічні в діагностичному плані IgG-антитіла. Разом з тим IgM-антитіла з'являються в крові раніше інших. Вони можуть утворюватися і у здорових осіб в результаті "побутової" імунізації або внаслідок раніше перенесеної інфекції, тобто IgM-антитіла менш специфічні.

7.6. IgM-антитіла інактивуються при обробці сироватки крові цистеїном, тоді як IgG-антитіла резистентні до цього препарату. Після обробки сироватки крові цистеїном в РПГА виявляються тільки IgG-антитіла, тим самим підвищується специфічність реакції.

Швидкість утворення антитіл і їх титр залежать від віку хворого, стадії і тяжкості перебігу хвороби, стану преморбідного фону і інших чинників.

7.7. Порядок проведення дослідження сироватки крові людини. Сироватку крові дорослих людей досліджують двічі: відразу після надходження хворого в стаціонар і на другому тижні хвороби, а при нагоді дослідження проводять і в період реконвалесценції.

7.8. Сироватку крові дітей перших двох років життя досліджують в динаміці відразу після надходження дитини в стаціонар, потім кожні 7 - 10 днів.

При неможливості проведення повторних досліджень одноразове серологічне обстеження призначають в наступні терміни залежно від віку дитини:

до 1 року при легкій і середньо-важкій формах - на третьому тижні хвороби, при важкій формі - на четвертому - шостому;

у віці 1 - 3 років - на другому тижні незалежно від тяжкості хвороби;

старше за 3 роки незалежно від тяжкості хвороби - на шостий - сьомий день. У таблиці N 12 приведений рівень антитіл в крові дітей.

Таблиця 12. Рівень антитіл в крові дітей

7.9. Постановка РПГА. Сироватку крові досліджують в РПГА з комплексним антигеном без цистеїну. При високому (не нижче 1:320) титрі або наростанні рівня антитіл (і негативному результаті бактеріологічного дослідження) сироватку досліджують в РПГА зі всіма груповими O-діагностикумами. При цьому слід враховувати, що у разі хронічного носійства титри сумарних антитіл можуть бути і нижчими. В цьому випадку при позитивному результаті бактеріологічного дослідження для з'ясування характеру носійства необхідно ставити РПГА з цистеїном.

7.10. Визначення антитіл в РПГА без цистеїну. Для постановки реакції досліджувану сироватку крові розводять 0,85 % розчином натрію хлориду на фосфатному буфері (pH 7,0 - 7,2) в співвідношенні 1:10.

У реакції використовують комерційні еритроцитарні сальмонельозні O-діагностикуми основних серологічних груп (A, B, C₁, C₂, D і E) і комплексний (полівалентний) O-діагностикум.

Подальший хід дослідження відповідно до Інструкції по застосуванню набору реагентів "Діагностикум еритроцитарний сальмонельозний O-антигенний рідкий".

7.11. Визначення антитіл в РПГА з цистеїном. Для визначення в сироватці крови питомої ваги IgG-антитіл готують розчин цистеїну. Для цього 10 - 15 мг солянокислого L-цистеїну або "вільного" цистеїну кваліфікації "ч" розчиняють в 1 см³ 0,1 N розчину їдкого натрію. pH готового розчину має дорівнювати 7,0 - 7,2. Приготовлений розчин зберігають не більше 1 год.

Досліджувану сироватку розводять 0,85 % розчином натрію хлориду у співвідношенні 1:5 і змішують з рівним об'ємом розчину цистеїну. Пробірку герметизують (гумовою пробкою, лейкопластирем, парафіном) і поміщують в термостат на 18 - 20 год. при температурі (37±1) °C.

Подальше дослідження проводять відповідно до Інструкції по застосуванню набору реагентів "Діагностикум еритроцитарний сальмонельозний O-антігенний рідкий", при цьому в розчин для титрування додають 1 % нормальної інактивованої сироватки крові (коня, кроля, великої рогатої худоби). Сироватка має бути перевірена на відсутність антитіл діагностикумів, що використовують.

7.12. Облік РПГА і інтерпретація результатів. Результат реакції вважають позитивним, якщо еритроцити повністю аглютиновані і розміщені рівномірно на дні лунки або при майже повній аглютинації невелика частка еритроцитів осідає у центрі лунки у вигляді рівного кільця або ґудзика. Іноді при позитивній реакції краї аглютинату в лунках можуть злегка сповзати, і він приймає вигляд "парасольки". При негативному результаті аглютинату немає, еритроцити осідають на дні в центрі у вигляді ґудзика або рівного кільця.

При обстеженні осіб, що піддалися ризику зараження або підозрілих як джерело збудника інфекції, виявлення (зазвичай у низьких титрах) антитіл в РПГА без цистеїну і відсутність їх при дослідженні сироватки в РПГА з цистеїном може бути розцінено як транзиторне носійство сальмонел.

Достатньо високий титр в РПГА з цистеїном вказує на можливе хронічне носійство сальмонел або перенесене захворювання на сальмонельоз (навіть субклінічно) протягом останніх 1 - 2 місяців.

У випадку контролю за бактеріоносійством стабільне зниження титру антитіл (особливо IgG), підтверджене негативними результатами бактеріологічних досліджень, дозволяє зробити висновок про звільнення організму від збудника.

8. Метод імуноферментного аналізу (ІФА)

Основою методу є твердофазний імуноферментний аналіз на полістиролових планшетах, покритих моноклональними антитілами до термостабільного антигену бактерій. Результатом проведення ІФА слугує утворення комплексу антиген-антитіло при дослідженні зразків порівняно з негативними і позитивними контролями. Використання твердої фази дозволяє надійно розділяти компоненти реакції за рахунок імобілізації одного з компонентів, що не беруть участь в реакції.

Використання 96-лункового ІФА-планшета дозволяє виконувати дослідження від 1 до 94 зразків одночасно. Проведення досліджень і облік результатів відповідно до інструкції про застосування.

9. Метод латекс-аглютинації

Метод дозволяє швидко визначити наявність сальмонел основних серологічних груп А, В, С, Д, Е в культуральних бульйонах та (або) виділених чистих культурах.

Принцип методу - взаємодія специфічних антитіл сальмонел, нанесених на латексні частинки різного кольору, з антигенами сальмонел, що містяться в бульйоні або суспензії культури. В ході аналізу кольорові латексні частинки утворюють агрегати із специфічними антигенами сальмонел, що супроводжується зміною кольору. Облік результатів візуальний по наявності конгломератів аглютинації, колір яких відповідає конкретній серологічній групі сальмонел. Дослідження займає 4 хвилини і використовується як додатковий підтверджуючий тест в комбінації з методом ІФА, а також класичними або з імпедансним методами.

Проведення досліджень і облік результатів згідно інструкції про застосування препаратів.

10. Імунохроматографічні експрес-тести

Імунохроматографічні експрес-тести являють собою діагностичну тест- панель з лункою для внесення зразка і віконцем з тестовою і контрольною зонами.

Принцип дії заснований на методі візуальної імунохроматографії - різновиду імуноферментного аналізу. Антигени бактерій, що визначаються, якщо вони присутні в досліджуваному зразку, взаємодіють з міченими золотом антитілами з утворенням комплексу антиген-антитіло. При проходженні по підкладці тесту комплекс антиген-антитіло зв'язується з імобілізованими антитілами з утворенням червоних ліній в тестовій і контрольних зонах.

Досліджують заздалегідь збагачені зразки. Проведення досліджень і облік результатів згідно інструкції про застосування тестів. Метод є орієнтовним і потребує підтвердження.

11. Молекулярно-генетичні методи

Застосування молекулярно-генетичних методів дозволяє оптимизувати процедури визначення збудника в досліджуваному матеріалі, скоротити термін досліджень і підвищити їх специфічність. В даний час застосування молекулярно-генетичних методів розглядається не як альтернатива класичному методу, а як необхідне його доповнення.

При роботі з клінічним матеріалом виявлення ДНК сальмонел може використовуватися як скринінговий діагностичний тест при груповій захворюваності на сальмонельоз і при обстеженні пацієнтів на фоні антибактеріальної терапії.

Здатність виявлення нежиттєздатних мікроорганізмів дає можливість результативного дослідження зразків при негативних результатах культурального методу (продукти харчування після термічної обробки, з порушеними термінами зберігання, клінічні зразки від пацієнтів на фоні антибактеріальної терапії).

Доцільно їх застосування в складних випадках ідентифікації культур Salmonella spp. класичними методами.

Однак при застосуванні і інтерпретації результатів молекулярно-генетичних методів необхідно враховувати наступне:

об'єктом детекції є ДНК збудника, виявлення якої не є доказом життєздатності мікроорганізму;

аналітична чутливість різних тест-систем на основі методу ПЛР коливається в межах 100 - 500 бактеріальних клітин/см³, і, у ряді випадків, може поступатися аналітичній чутливості мікробіологічного дослідження з використанням середовищ селективного збагачення;

спектр специфічності комерційно доступних тест-систем дозволяє лише виявляти мікроорганізми роду Salmonella, без серогрупової диференціації між ними;

при дослідженні проб харчових продуктів виявлення ДНК сальмонел вимагає підтвердження наявності збудника культуральними методами;

різні методи оцінки ідентичності ДНК мікроорганізмів роду Salmonella, виділених з різних джерел, мають максимальну інформативність при їх використанні на чистих культурах, виділених при первинному дослідженні зразків.

11.1. Виявлення ДНК мікроорганізмів роду Salmonella
в різних видах біологічного матеріалу і продуктах харчування

Для виявлення ДНК мікроорганізмів роду Salmonella в клінічному і біологічному матеріалі використовуються діагностичні тест-системи, дозволені до застосування на території України в установленому порядку. Перевагу віддають тест-системам, що мають максимальний ступінь контамінаційної безпеки (тест-системи з гібридизаційно-флуоресцентною детекцією в режимі реального часу або по кінцевій точці).

Клінічний матеріал для дослідження (зразки випорожнень, блювотні маси, жовч) слід забирати, виключаючи його можливу контамінацію ДНК, для цього використовують стерильні чашки Петрі, одноразові пластикові пакети, що підкладаються в судно перед дефекацією, відбирають проби випорожнень з памперсів. Багаторазовий посуд має бути автоклавований для руйнування залишкової ДНК.

При одночасному проведенні молекулярно-генетичного і мікробіологічного досліджень можливий уніфікований відбір клінічного матеріалу і проб харчових продуктів відповідно до рекомендацій, представлених у розділі 4 цих методичних вказівок.

Умови, терміни зберігання і транспортування біологічного матеріалу, методів його попередньої обробки визначаються інструкцією до тест-системи, що використовується.

Виділення ДНК мікроорганізмів роду Salmonella із проб продуктів харчування проводять після попереднього збагачення відповідно до рекомендацій, представлених в розділі 5 цих методичних вказівок. Подальше виявлення ДНК сальмонел в культуральному середовищі проводять без додаткової обробки відповідно до інструкції про застосування тест-системи.

11.2. Оцінка ідентичності ДНК мікроорганізмів
роду Salmonella, виділених з різних джерел

Для оцінки ідентичності ДНК мікроорганізмів роду Salmonella використовуються молекулярно-генетичні методики, що забезпечують:

необхідну для досліджень роздільну здатність (здатність диференціювання штамів мікроорганізмів, циркулюючих на даній території);

міжлабораторну відтворюваність результатів досліджень, відсутність суб'єктивізму при інтерпретації їх результатів.

Перевага надається методикам, що широко використовуються в світі, це дає змогу провести зіставлення отриманих результатів з міжнародними даними (мультилокусне секвенування-типування - MLST і його варіанти, ампліфікація тандемних повторів зі змінною копійністю - VNTR і його варіанти, електрофорез в пульсуючому гелі - PFGE, оцінка поліморфізму довжини фрагментів ампліфікації - AFLP тощо). Бажано застосування методик, що дозволяють провести міжлабораторне порівняння отриманих результатів дослідження.

Оцінка ідентичності штамів при спорадичній захворюваності не може свідчити про епідеміологічний зв'язок між джерелами їх виділення, а лише дозволяє виключити його наявність. Епідеміологічна інтерпретація ідентичності доцільна тільки в рамках комплексного епідеміологічного розслідування групових захворювань або спалаху.

12. Вимоги безпеки

Вимоги безпеки, загальне розташування лабораторії, а також її інфраструктура повинні відповідати вимогам державних санітарних правил ДСП 9.9.5.-080-2002 "Правила влаштування і безпеки роботи в лабораторіях (відділах, відділеннях) мікробіологічного профілю".

Застереження! Селеніт натрію та його розчини, що використовуються при дослідженні, небезпечні (вимагають обережного обігу). Уникати дотику і вдихання парів. При попаданні на шкіру негайно змити великою кількістю води.

Начальник Управління громадського
здоров'я А.А. Григоренко

Додаток 1
до Методичних рекомендацій
"Методи виділення та ідентифікації сальмонел"

Схема Кауфмана-Уайта

З Додатком 1 можна ознайомитись: розділ "Довідники", підрозділ "Додатки до документів", папка "Накази".

Начальник Управління громадського
здоров'я А.А. Григоренко

Документи що посилаються на цей